细说Western Blot

(三) 电泳

1．上样前将胶板下的气泡赶走。

2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。

2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。

3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

电泳液配方：Tris-base 3g,  glycine 14.4g,  0.1% SDS（10ml 10%SDS）/L

            Tris-base 1.5g,  glycine 7.2g, 0.1% SDS（5ml 10% SDS）/0.5L

(四) 转膜

1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：

       湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly 14.4g， M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS  180ul。浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。

2．取胶：

    将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）

3．转膜：

湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。

电转液配方： Tris-base 3g,  glycine 14.4g,  200ml 甲醇/1L

(五)  封闭及杂交

1．封闭：

              将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。

2．结合一抗：

    一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。

           反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3．洗涤：

    一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．结合二抗：

    根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。

5．洗涤：

二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

PBST： 1×PBS                    TTBS： Tris-HCl  20mM,pH 7.4 (25℃)

Tween-20  0.01% ~0.02%           NaCl      150mM

Tween-20   0.05%

封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。