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做荧光定量PCR时, CT值在什么范围内比较好?

在做荧光定量PCR时,有个很重要的概念,就是“CT”。有经验的同学会根据CT值的范围来初步判断这个实验结果是否合理。

 

那么,什么是CT值呢?

CT在什么范围内比较好呢?

 

1,什么是CT?

CT,是Cycle Threshold的简写,一般译为“循环阈值”(阈,读音yù,外“门”内“或”,不要误以为“阀”哦)。简单说,这是一个临界点。在这个点之前,荧光曲线是近乎“平”的,从这个点开始,荧光曲线忽然开始耸立起来(俗称为“起飞”),进入了传说中的“指数增长期”。不同样品、不同基因的CT值有可能是不同的。而这个点所对应的循环数值,就是后来我们进行基因含量计算的重要依据。见下图

640.webp.jpg

 

2,CT在什么范围内比较好呢?

在荧光定量PCR实验中常有一个内参基因作为你的目的基因的参照。这样,你在结果中应该关注两个CT值:

一是你的目的基因的CT值

二是内参基因的CT值

 

常见的荧光定量PCR实验,循环数多半设定为40个。一般认为,CT值太大或者太小,都是不可信的。如果太小,比如小于10,则因为在此阶段荧光读值还不是很稳定,所以读到的值有可能不准。如果太大,比如大于35,则反应的随机性增大、三复孔间的误差可能会比较大,而且有可能伴随有非特异性产物的影响。

一般认为,内参基因的表达量比较高,通常远大于目的基因。内参基因的CT值要大于10——接近于20,目的基因的CT在20几到30左右(通常小于35),都是比较理想的范围。这样的CT值算出的结果是可信的。

 

如果你得到的CT值落在这个范围之外,太大或太小,就要小心结果有可能不准。

 

— 解决方法 —


调整一下模板DNA的浓度,提高或者降低模板DNA的浓度,会相应改变CT值,最终使之处于一个合理的范围内。这样的结果才是可信的。见下图

640.webp (1).jpg

 

顺带说一下:我们平时得到的CT值是仪器使用默认参数下给出的。实际上这些参数我们是可以人为进行调整的。

 

比如图一和图二中的阈值(即Threshold这条横线)的高度,在软件中其实是可以手动调节的。个别情况下有可能需要这样的操作。这样得出的CT值就会略有不同。当然,如果你的实验结果比较精确的话,这样的调整并不会改变目的基因与内参基因的相对关系,所以最终算出的结果——即相对趋势——并不会有本质上的变化。


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