干货分享 | 热启动酶耐热机制全面解析

常规PCR技术因能够快速扩增任何已知的DNA片段而被广泛应用于分子生物学的各个领域。但常规型PCR技术容易出现引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等现象，造成实验结果的不准确性。热启动型PCR能够很好的解决上述问题，是最常用的提高PCR特异性的方法。

热启动酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰和抗体修饰等，不同的热启动修饰方法原理上有所区别，各有优劣势。

化学法

图1. 化学法修饰热启动酶原理图

配体法

配体法修饰，主要借助核酸适配体封闭酶活。顾名思义，核酸适配体一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸。作为一种寡核甘酸序列的识别分子，作用的靶分子范围广泛，从无机金属的小分子到生物领域的大分子。这些适配子可以形成特定的空间构象，从而在表观功能上与抗体类似。对蛋白质或其他小分子物质具有高度特异性、亲和力。核酸适配体通过非共价键与DNA聚合酶结合，进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。一般核酸适配体的筛选所需周期较短，整个过程能够依赖自动化，简便快捷。

图2. 配体法修饰热启动酶原理图

抗体法

图3. 抗体法修饰热启动酶原理图

表1. 热启动酶常见修饰方法优劣势比较

以上简单介绍了热启动酶的常见类别和各种热启动方法的优劣势，其中化学修饰物不能够批量合成，而且需要较长的激活时间聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好，到40°C时，聚合酶的活性就被释放出来，特异性不好；而抗体法修饰热启动酶对应的封闭效果最佳，酶活释放速度快，从而大大降低PCR反应时间，是目前IVD市场上应用较多的一种热启动酶改造方法。

热启动酶在热启动PCR的应用方面较为广泛，不仅有效防止非特异性PCR产物，而且在较难扩增的PCR反应如单拷贝基因的扩增、多重PCR和超长片段的扩增等应用尤为突出，大大改观了传统PCR技术的局限性。在病原微生物检测、遗传病诊断和法医鉴定等各个领域等实际应用中颇为广泛。