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干货分享 | 热启动酶耐热机制全面解析

常规PCR技术因能够快速扩增任何已知的DNA片段而被广泛应用于分子生物学的各个领域。但常规型PCR技术容易出现引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等现象,造成实验结果的不准确性。热启动型PCR能够很好的解决上述问题,是最常用的提高PCR特异性的方法。


热启动酶(Hot start enzyme主要利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性,加热至变性温度时修饰物失活,释放酶活,从而使PCR反应得以正常进行。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰抗体修饰等,不同的热启动修饰方法原理上有所区别,各有优劣势。


化学法

DNA聚合酶的化学法修饰,一般采用化学小分子如酸酐等有机物与聚合酶上的侧链氨基酸(赖氨酸)通过化学反应相互作用,使酶低温时失去酶活,温度升高后,酸酐与氨基之间的化学键断裂,酶活释放,从而达到热启动效果。化学修饰可有效封闭酶的活性,操作简单,但酶活性释放速度较慢,依赖温度激活DNA聚合酶,能有效抑制非特异性产物,可在室温下配置反应体系,且对PCR反应buffer要求较高。

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1. 化学法修饰热启动酶原理图


配体法

配体法修饰,主要借助核酸适配体封闭酶活。顾名思义,核酸适配体一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。作为一种寡核甘酸序列的识别分子,作用的靶分子范围广泛,从无机金属的小分子到生物领域的大分子。这些适配子可以形成特定的空间构象,从而在表观功能上与抗体类似。对蛋白质或其他小分子物质具有高度特异性、亲和力。核酸适配体通过非共价键与DNA聚合酶结合,进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。一般核酸适配体的筛选所需周期较短,整个过程能够依赖自动化,简便快捷。

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2. 配体法修饰热启动酶原理图


抗体法

抗体法热启动酶一般考虑使用DNA聚合酶抗体封闭酶活性,使其在低温时处于无活性状态,在加热至变性温度时抗体变性,解除封闭从而释放活性,可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因,封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时,增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率,从而保证低丰度基因的有效检出,大大提升反应灵敏度和扩增效率。

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3. 抗体法修饰热启动酶原理图


1. 热启动酶常见修饰方法优劣势比较

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以上简单介绍了热启动酶的常见类别和各种热启动方法的优劣势,其中化学修饰物不能够批量合成,而且需要较长的激活时间聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好,到40°C时,聚合酶的活性就被释放出来,特异性不好;而抗体法修饰热启动酶对应的封闭效果最佳,酶活释放速度快,从而大大降低PCR反应时间,是目前IVD市场上应用较多的一种热启动酶改造方法


热启动酶在热启动PCR的应用方面较为广泛不仅有效防止非特异性PCR产物,而且在较难扩增的PCR反应如单拷贝基因的扩增、多重PCR和超长片段的扩增等应用尤为突出,大大改观了传统PCR技术的局限性。在病原微生物检测、遗传病诊断和法医鉴定等各个领域等实际应用中颇为广泛。



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