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超全荧光定量PCR应用常见问题汇总!


实时荧光定量技术是什么

20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量,目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。


常见问题罗列

没有CT值

实验结果一旦遇到没有Ct值情况,就要在第一时间排查是否有以下问题:


(1)循环数不够(但是一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

(2)PCR程序设置不对,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

(3)引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

(4)模板量可能降解或上样量不足(但一般不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样品准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样品小量分装储备,避免反复冻融;

(5)引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

CT值过晚

在相对定量中,Ct值一般控制在15~25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。


(1)扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;

(2)PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

(3)MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

(4)PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

(5)模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。


标准曲线线性关系不佳

如果遇到标准曲线线性关系不佳R2<0.9的情况,那么很有可能是以下环节存在问题:


(1)标准品稀释或者加样存在误差,吸样不准,使得标准品不呈梯度;


(2)标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,不要反复冻融,现配现用;


(3)引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针;


(4)模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量不超过500ng,以50~500ng为宜。

阴性对照扩增有信号

如果阴性对照扩增有信号,首先排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:


(1)引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。


(2)引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。


(3)镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒。


(4)模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。


(5)交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染,或操作环境中有气溶胶造成污染,建议对操作环境进行处理,或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。


熔解曲线峰不特异

如果熔解曲线峰不特异,那么很有可能是以下环节存在问题:


(1)引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现,这是最主要因素;引物浓度不佳,尤其是涉及二聚体存在时,适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度比例;


(2)离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒,不同试剂盒在该方面的优化能力不适合,有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果;


(3)模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。

扩增效率低

该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:


(1)反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解;


(2)反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间;


(3)反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。

扩增曲线的异常

如果遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,那么很有可能是以下环节存在问题:


(1)模板的浓度太高或者降解;

(2)荧光染料的降解;

(3)在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等;

(4)液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;

(5)气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。


参考文献:

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits (EUROGENTEC)


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