Nature Biotechnology：特异性更高安全性更好的高保真版Cas13系统

Design, screening, and characterization of engineered, high-fidelity Cas13 variants — **图:设计、筛选和描述工程的高保真Cas13变体**

最近一项新研究揭示了通过突变，高保真Cas13变异的发展，显著降低附带影响。它还证明了hfCas13在哺乳动物细胞和动物中有效的靶向RNA降解的可行性，几乎没有附带损伤。

这项工作由中国科学院神经科学研究所(脑科学与智能卓越技术中心)杨辉博士实验室的研究人员和汇根治疗有限公司的研发团队完成。

CRISPR-Cas13系统是一种高效的可编程RNA靶向工具，已被用于各种细胞类型和生物体的核酸检测和RNA操作。然而，Cas13的脱靶效应引起了人们的担忧。先前的结构研究表明，当Cas13与靶RNA结合时，两个HEPN核酸酶结构域可能会在蛋白表面形成催化位点，从而产生除靶RNA的靶内切割外，旁观者RNA的混杂切割的可能性。

由于这种所谓的附带效应，Cas13可能会随机降解靶RNA和非靶RNA，因此在使用Cas13时，实验设计和结果解释变得困难。

因此，在Cas13系统的基础研究和未来的体内应用中，需要通过工程方法来减少或消除混杂的RNA降解。

在这项研究中，研究人员设计了一个双荧光报告质粒系统(EGFP和mCherry)来检测Cas13在哺乳动物细胞中的附带作用。在该系统中，mCherry荧光细胞的丢失被解释为成功的靶向编辑;EGFP荧光细胞缺失被解释为脱靶裂解。结果表明，Cas13a或Cas13d均可诱导明显的副反应。

然后，研究人员试图通过诱变来设计Cas13d (RfxCas13d，一种来自黄胃瘤胃球菌XPD3002的Cas13d)，并基于一种新的精心设计的双荧光报告系统，包括一个含有EGFP、mCherry和EGFP靶向gRNA的单质粒，以及每个Cas13变体，筛选附带影响最小的变体。

杨辉团队设计并生成了Cas13d变异体的突变文库，并将其单独转染到HEK293细胞中。通过流式细胞术分析报告荧光，5个变体(N1V7, N2V7, N2V8, N3V7和N15V4)表现出EGFP+细胞的比例相对较低，而mCherry+细胞的比例较高，表明具有较高的靶向活性，侧枝活性降低。

由于其对RNA降解的高特异性，被称为高保真Cas13d (hfCas13d)的变体N2V8被用于进一步的表征，包括使用RNA测序进行全转录组脱靶分析。当针对PPIA等几种内源性转录本时，hfCas13d显示出明显的脱靶基因数量减少。此外，hfCas13变异对细胞系、转基因动物和体细胞没有可检测到的附带损伤，因此支持其在体内应用。

杨辉团队在2021年发现了CRISPR-Cas13X系统，这是目前最小的(只有775个氨基酸)RNA编辑工具。在他们的新研究中，研究人员进一步改造了Cas13X，并获得了hfCas13X变体，该变体对靶向RNA降解具有很高的特异性，但间接影响很小。hfCas13X在基于RNA编辑的基因治疗领域显示出巨大的应用潜力。