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加州大学圣巴巴拉分校生物学家Chris Richardson实验室的研究人员在这个不断增加的工具箱中添加了一种方法，该方法可以提高CRISPR/Cas9编辑的效率，而无需使用病毒材料来提供用于编辑靶标基因序列的遗传模板。根据他们发表在《自然-生物技术》杂志上的新论文，这一方法在不增加突变频率或改变末端连接修复结果的情况下，将同源定向修复(基因编辑过程中的一个步骤)提高了大约三倍。

Richardson说：“我们发现了一种化学修饰，可以改善非病毒基因编辑，还发现了一种名为“DNA修复”的有趣新方法。”

查找、剪切和粘贴

CRISPR/Cas9方法的工作原理是利用细菌对病毒攻击者的防御技术。为了做到这一点，细菌剪断入侵病毒的一块遗传物质，并将其整合到自己的遗传物质中，以便日后识别。如果细菌再次感染，它们可以针对现在熟悉的基因序列进行破坏。

在基因编辑中，这一过程使用Cas9酶作为分子“剪刀”，在CRISPR系统的指导下剪切其识别的序列。这种切割也是一个机会，可以利用细胞的自然修复机制，用相似（同源）但经过改进的基因取代被切割的基因。如果成功，则该细胞应具有修改后的表达和功能。

为了将修复模板DNA输送到其遗传物质所在的细胞核，通常会使用病毒。研究人员表示，尽管它们是有效的，但病毒工作流程“成本高昂，难以扩展，对细胞有潜在毒性。”

尽管研究人员仍必须克服效率和毒性障碍，但非病毒模板可能更便宜、更具可扩展性。实验室在他们的研究中发现，在工作流程中引入链间交联（interstrand crosslinks）能显著增加了同源性定向修复。

Richardson说：“我们采用这种方法的每一个工作流程的效果都好了大约三倍。”

链间交联是使DNA螺旋的双链相互连接，使其无法复制的损伤。癌症化疗使用这种机制来阻断肿瘤生长并杀死癌症细胞。然而，添加到同源定向修复模板中，发现这些交联可以刺激细胞的自然修复机制，并增加编辑成功的可能性。

“基本上，我们所做的就是获取模板DNA并对其进行破坏。事实上，我们已经以我所能想到的最严重的方式破坏了它。细胞不会说，‘嘿，这是垃圾；让我把它扔掉。’细胞实际上说的是，‘嘿，这看起来很棒；让我将它粘贴到我的基因组中。’”结果就是得到一个高效、不易出错的非病毒基因编辑系统。

他们的发现，就像科学上的许多突破一样，实际上是一个令人高兴的意外。研究员兼首席作者Hannah Ghasemi在致力于纯化蛋白质以研究DNA修复时，注意到他们的实验结果发生了意想不到的变化。

“我们在DNA模板上引入了这些化学修饰，以便能够将它们从细胞中提取出来，看看哪些蛋白质与它们结合，我只是想看看这种修饰是否以某种方式影响了编辑。我原本预计要么不会看到任何变化，要么实际上可能会对编辑产生负面影响。”

结果没想到发现了一种积极的效果，编辑活动是未交联控件的三倍。此外，该团队发现，即使编辑次数增加，因此出现错误的机会也增加了，突变频率也没有增加。他们仍在调查导致这一结果的具体机制。

“我们认为，细胞会检测并试图修复我们添加了这种交联的受损DNA。在这样做的过程中，它会延迟细胞通过一个检查点，在那里它通常会停止这种重组过程。因此，通过延长细胞进行这种重组所需的时间，它使编辑更有可能完成。研究这一新过程也可以更好地了解细胞是如何检测编辑试剂的，以及它们是如何“决定”接受或不接受这些试剂的。”

该团队表示，这种方法将在离体基因编辑应用中最有用处，即在疾病研究和临床前工作领域。