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综述：用于研究肌动蛋白网络结构和动态的重组系统肌动蛋白（Actin）作为真核生物中普遍存在的蛋白质，在细胞形态维持、迁移、分裂等多种功能中至关重要。尽管从分子到生物体尺度的研究广泛，但肌动蛋白动态结构调控、与膜相互作用及机械特性等基本问题仍存疑。本综述围绕简化重组系统在解决这些问题中的价值展开，重点关注宏观网络层面的重组。 研究背景与重组系统的重要性肌动蛋白在所有测序真核生物中均存在，浓度因细胞类型而异（10-150 μM）。在肌动蛋白结合蛋白作用下，肌动蛋白丝自组装成不同结构。自 1942 年发现以来，虽经广泛研究，但肌动蛋白细胞骨架的许多方面，如结构尺寸定义、组装与解聚平衡、网络动态转化等机制仍未完全明确。细胞内环境复杂，难以解析具体机制，因此重组系统尤为重要，尤其是宏观网络重组，可精准确定特定过程所需的最小组分及浓度。 单丝研究与冷冻电镜方法的贡献体外通过批量实验研究肌动蛋白动态，确定调控蛋白对组装解聚的影响及速率常数。荧光显微镜、全内反射荧光（TIRF）成像及微流控系统等对单丝的研究，可分别探讨组装、解聚、循环等步骤，还能发现分支形成、机械反应等批量实验无法观察的特性。单分子研究进一步揭示 WASP 和 Arp2/3 复合物的分支形成机制。冷冻电镜分辨率的提升，提供了肌动蛋白聚合及其与相关蛋白相互作用的新分子细节。然而，理解蛋白如何共同调控肌动蛋白网络动态，需将研究扩展至介观尺度，衔接分子复合物与细胞内环境。 宏观重组的优势与环境模拟宏观重组在网络层面重建动态肌动蛋白网络具有多方面优势。肌动蛋白结合蛋白的行为依赖于网络结构，重组网络有助于理解其结合差异。三维重建显示外力影响网络结构和生化动态，物理化学参数如大分子拥挤度、粘度、能量可用性等对细胞骨架特性塑造关键，局部和全局的肌动蛋白及结合蛋白消耗也影响网络大小和动态。 细胞内反应空间为微米级，分子数量有限且受边界影响。通过微孔、油包水液滴、囊泡等限制环境模拟细胞质，可评估物理化学参数对细胞过程的影响。限制环境不仅用于机械研究，如观察对肌动蛋白丝曲率的影响，还可模拟组分有限的细胞条件，研究其对肌动蛋白动态维持及竞争网络共存的影响，对研究局部蛋白消耗效应也至关重要。 宏观重组的工具与方法宏观重组需时空控制肌动蛋白聚合。细胞中肌动蛋白聚合由激活剂和核化因子局部调控，重组系统中主要工具包括覆盖脂质和 / 或聚合激活剂（如 WASP、formin）的微珠和微模式。 蛋白光激活可定位肌动蛋白网络形成或功能，通过光激活肌动蛋白单体或马达蛋白，实现激活的瞬时性和激活区域大小形状的可控性。 微模式通过在钝化表面灼烧选定区域，创建肌动蛋白聚合 “点”。例如，Reymann 等人开发此方法定位成核促进因子（NPF），在可控位置生成不同形状的分支网络，二维或三维均可。近年，覆盖脂质双层的微模式可模拟膜附近的肌动蛋白聚合，激活永久且静态，模式尺寸和形状在灼烧阶段可控。 微珠和囊泡重组源于利用纯化蛋白重建单核细胞增生李斯特菌的持续运动。通过将 NPF 包被在微珠上，置于合适蛋白混合物中，可形成分支肌动蛋白丝彗星，推动微珠前进，其运动是肌动蛋白动态的可靠读数，网络大小、形状和强度可通过荧光显微镜测量。在卵提取物中利用包被 NPF 的囊泡重建运动，可探测 F - 肌动蛋白网络对膜施加的机械力。 微孔（微制造 chambers）长期用于微管的三维限制，可通过光刻法构建，腔壁易功能化特定蛋白或脂质，肌动蛋白已成功封装其中。囊泡（脂质体）基于磷脂双分子层，是合成细胞领域封装的首选，肌动蛋白也可封装，但蛋白封装具挑战性且 reproducibility 不一。油包水液滴易创建并填充蛋白，磷脂溶解于油中稳定乳液界面，作为表面活性剂减少液滴聚结，液滴和囊泡可变形，用于研究形状对蛋白组织的影响，是合成细胞领域解决运动和细胞分裂等挑战的有力工具。 支持脂质双层（SLBs）是模拟质膜的强大系统，由玻璃盖玻片功能化各种脂质组成，脂质与底物间有薄水层允许脂质横向移动，可与其他工具结合，如创建脂质微模式，便于 TIRF 显微镜成像。 上述方法可结合使用，如 SLBs 用于设计脂质微模式研究摩擦力对肌动球蛋白收缩性的影响，NPF 包被微珠或微模式引入微孔研究组分有限的影响，巨单层囊泡（GUVs）铺在微模式上研究囊泡形状对肌动蛋白取向的影响，不同脂质组成的 GUVs 自发分离成域，可靶向肌动蛋白聚合至特定域。 宏观重组解决的问题与应用肌动蛋白结构对各过程的影响细胞中多种结构共存并共享肌动蛋白单体和结合蛋白池，过去十年，理解同一蛋白池如何介导细胞多种功能是关键问题。在微模式上重建各种结构，可研究多种因素对网络收缩性及整体形状变化的影响，如结构（分支或线性网络）、连接性（丝交联程度）、边界（肌球蛋白活跃区域）、肌动蛋白网络与相互作用底物间的摩擦等。在脂质双层上大规模重建各种结构，深入了解网络结构对应力产生的影响，发现收缩性具有高度协同性和伸缩性。通过在油滴中重建肌动球蛋白网络，显示网络结构对肌球蛋白能量消耗的影响。微模式上的重建还揭示网络结构对解聚的选择性及网络密度对肌动蛋白解聚因子（ADF）/cofilin 介导解聚的影响。 通过在聚苯乙烯微珠上重建分支和线性网络，研究蛋白结合和定位在分支与线性网络竞争中的情况，发现 profilin 限制分支网络生长但促进线性网络生长，蛋白竞争和分选依赖肌动蛋白结构。在微米级微珠表面定位两种不同蛋白，可解析蛋白 proximity 对树突状网络形成的影响，如共定位 lamellipodin 和 VCA 显示 lamellipodin 减缓分支网络组装，同时定位 Arp2/3 复合物激活剂和 Myosin-I 显示 Myosin-I 可增强分支网络的力生成能力。 未来，在重组中考虑肌动蛋白结合蛋白在各种肌动蛋白亚型及具翻译后修饰的肌动蛋白上的结合，对理解细胞中具不同生化特性的网络形成至关重要。此外，肌动蛋白网络的形状和功能在真核生物谱系中的进化和多样化仍知之甚少，虽结构和单丝方法已开始研究，但网络尺度的研究可评估不同动态对不同肌动蛋白网络功能和特性的影响。 肌动蛋白与微管网络的相互作用肌动蛋白丝与微管的相互作用对多种细胞功能至关重要。同时重建动态肌动蛋白和微管网络的生化条件，揭示肌动蛋白网络结构调控微管生长和动态、引导微管组织或运动并作为结构记忆、介导中心体定位等机制。工程化将生长微管末端与肌动蛋白丝连接的蛋白（TipAct）显示，生长微管可被刚性肌动蛋白束捕获和引导，导致整体肌动蛋白 - 微管对齐，表明两者可相互影响组织。 然而，肌动蛋白 - 微管相互作用的分子机制，如两者对齐时摩擦力对聚合物动态的影响假说，仍需验证。未来研究两者相对位置及对信号传导的潜在影响，是更好理解细胞中两者串扰的令人兴奋的方向。 结构的动态与周转肌动蛋白结构的动态性对细胞适应变化环境至关重要，不同结构周转速率不同，如片状伪足或内吞结构周转快，应力纤维较慢。理解这些周转速率如何建立和维持、组装与解聚速率如何通过反馈协调以维持结构大小恒定是挑战，动态稳态结构的重建对理解肌动蛋白周转基本机制至关重要。 McCall 等人重建缠结肌动蛋白丝，显示非平衡周转对丝动态和力学的影响，ADF/cofilin 促进网络流体化。Guo 等人发现肌动蛋白结合蛋白 CAP（Cyclase-associated Protein）和 Abp1（Actin-binding protein 1）可将分支肌动蛋白网络大幅聚集成束。 在微珠或微模式上重建分支或线性网络，为周转循环各步骤提供见解。WASP 包被微珠周围重建分支网络，显示形成类似细胞中丝状伪足的星状网络的最小成分。利用纯化蛋白重建细菌运动，显示封端蛋白对运动速度的依赖，进一步研究表明封端蛋白通过促进更频繁的丝成核提高运动速率。微珠运动分析还指出 ATP 水解在分支肌动蛋白网络组装和解聚中的关键作用，formin 基运动无需封端蛋白，封端蛋白甚至导致 formin 包被微珠停滞。在微珠或微模式上重建肌动蛋白周转，解析 ADF/cofilin 的随机切断如何通过释放肌动蛋白束的大部分促进网络周转，解聚速率依赖网络密度、结构及 cofilin 浓度。Fascin 交联的线性束保护束免受 ADF/cofilin 解聚。Pollard 等人发现七种纯化蛋白混合物足以重建具极化周转的电缆形成。微珠包被 NPF 和 formins 显示两者的协同活性及 formin 介导的抗 ADF/cofilin 去分支保护。近年研究结合微珠运动分析和微孔限制，显示循环对肌动蛋白网络长期周转的必要性及允许竞争结构在同一环境中共存。 未来，肌动蛋白周转各步骤（组装、解聚、循环）的分子机制已较明确，但如何平衡及存在何种反馈仍需探索。细胞和重组系统中均提出可用肌动蛋白单体池大小作为组装速率反馈的假说，需进一步验证。此外，不同大小和周转速率的结构如何共享有限蛋白池仍是关键未答问题，介观尺度重组系统可测试动态缩放的理论机制，通过限制环境精细调节蛋白数量、浓度、密度及介质物理特性，研究其对不同肌动蛋白结构大小和动态的影响。 肌动蛋白网络的机械特性细胞本质上受多种机械约束，在形态发生、迁移等过程中产生力。缠结和分支网络的历史重建及其被动或主动微流变工具分析，是理解肌动蛋白网络粘弹性的关键。向网络中添加肌球蛋白和交联剂显示，收缩性在马达和交联剂的最佳浓度下发生。 在微珠或囊泡周围重建肌动蛋白网络，对理解生长网络产生的力至关重要。最初在 HeLa 细胞提取物中使用包被 ActA 的微珠，估计肌动蛋白凝胶施加的力约为 10 pN，后续纯化蛋白研究显示物理特性对分支网络生长的影响及网络生化与物理特性的紧密耦合。此类分析还显示，移动微珠所需的对称性破坏基于弹性能量释放，类似聚合物凝胶的断裂，弹性凝胶对微珠施加摩擦力。在包被 Arp2/3 复合物激活剂的可变形物体（GUVs）上重建运动，显示物体的可变形性和激活剂在脂质表面的移动性影响肌动蛋白网络的动态和结构参数，这些分析提供了运动启动机制的更好理解。 在三维微模式上生长的分支肌动蛋白网络，结合原子力显微镜尖端对生长网络施加力，显示分支网络在负载下生长导致网络更密集和结构适应，类似细胞系统中的情况。从不同 NPF 密度的相似微模式在二维生长的分支网络产生异质网络，这种异质性显示强加运动方向。 利用功能化 talin 蛋白的微模式研究力的产生，揭示肌动球蛋白依赖的 talin-vinculin 复合物动态及拉伸 talin 激活 vinculin 诱导正反馈，增强肌动蛋白 - talin-vinculin 结合，肌动球蛋白力触发机械敏感蛋白 talin 上的蛋白结合。研究 vinculin 与微模式生长的分支网络的相互作用显示，vinculin 可在新生粘连处束状树突状肌动蛋白网络。 未来，微珠和微模式实验揭示了分支肌动蛋白网络的机械特性，这对运动、内吞等至关重要。未来利用纯化蛋白重建运动，将有助于理解细胞运动的最小元件及不同迁移类型的机制。在此背景下，重建粘连对理解分子机制和细胞运动的最小要求至关重要，通过在 GUVs 表面结合 talin，研究 talin、kindlin 和肌动球蛋白对系统聚集整合素能力的影响，已迈出粘连重建的第一步。 肌动蛋白与膜的相互作用（二维和三维）肌动蛋白与质膜的相互作用在细胞分裂、迁移、内吞等许多生物过程中起关键作用。肌动蛋白存在于膜下（形成皮层），质膜是肌动蛋白聚合调控的重要位点（通过 Pip2、Rho 通路等）。细胞运动时，肌动蛋白组装必须产生足够力移动质膜，两者存在相互作用：肌动蛋白聚合可增加膜张力，膜弯曲区域也可触发肌动蛋白聚合（如通过招募 BAR 蛋白）。 许多研究在脂质膜附近重建肌动蛋白网络。在二维使用 SLBs，Murrell 和 Gardel、Vogel 等人显示肌动蛋白对膜的粘附程度可调节网络收缩与 F - 肌动蛋白切断的耦合。近年研究显示脂质组成变化影响与膜的连接性，VASP（Vasodilator-stimulated phosphoprotein）在脂质上的结合促进大束形成。向脂质双层聚合的肌动蛋白皮层中添加肌球蛋白 II，观察到肌动蛋白网络的动态重组，还显示分支肌动蛋白网络与脂质的连接可调节摩擦并确定收缩轴。此外，肌动蛋白聚合可重组脂质（促进相分离），如 nephrin 附着于脂质双层促进多价相互作用和蛋白与其细胞质伙伴 Nck 和 N-WASP 的相分离，这些簇可组装分支肌动蛋白网络，提示膜处局部肌动蛋白组装的调控机制。 在三维，肌动蛋白与膜的相互作用主要通过 GUVs 研究，油包水乳液也可用于研究。许多研究聚焦于囊泡内外类似皮层结构的生成。Pontani 等人首次在脂质体内部重建肌动蛋白皮层，Carvalho 等人和 Loiseau 等人向皮层样结构添加肌球蛋白生成皮层张力，其水平由马达数量、网络连接性及其与膜的附着决定，观察到肌动蛋白皮层重塑及膜形状变化。后续研究探讨肌动蛋白结合蛋白如交联剂或封端蛋白对囊泡形状的影响，显示肌动蛋白网络连接性和膜附着对驱动大规模形状变化的重要性，这些囊泡形状变化在突起生成研究中广泛探讨，如分支肌动蛋白网络可使脂质体膜变形为 “丝状伪足样” 束状肌动蛋白突起，分支肌动蛋白网络（有封端蛋白）足以驱动膜内外变形，网络异质性有利于膜突起。肌动蛋白网络可感知膜曲率，水包油液滴内形成的肌动蛋白环自发定位在液滴赤道，靶向囊泡赤道平面的肌动球蛋白环可使囊泡变形，添加膜曲率传感器可招募肌动蛋白聚合酶 VASP 局部组装肌动蛋白丝并生成类似丝状伪足的突起。因此，在可变形囊泡内重建基于组装的肌动蛋白网络揭示了广泛的变形，可与细胞中观察到的变形比较，不同方法提供这些力大小的定量测量，这是理解与膜相关的肌动蛋白过程机制所必需的。 肌动蛋白与膜的相互作用也发生在货物运输中，货物多为囊泡，肌动蛋白丝与运输货物的马达的相互作用对细胞内物质的极化运输重要。在三维肌动蛋白网络中重建 myosin Va 运输脂质体，显示肌动蛋白结构（即肌动蛋白丝极性）对脂质体运输的影响，重建具 myosin1C 和 kinesin1 马达的复合肌动蛋白 - 微管网络，显示马达对囊泡变形及小管形成的影响。 未来，仍需精确破译膜处肌动蛋白组装的机制，尤其是肌动蛋白 - 膜连接蛋白与肌动蛋白相关蛋白相互作用对聚合调控的机制。此外，理解肌动蛋白 - 膜连接蛋白如何传递膜张力，将为所有涉及肌动蛋白 - 膜相互作用的过程提供更好的见解。在合成细胞开发领域，在囊泡内重建动态肌动蛋白网络仍是挑战，重建能够产生足够力使囊泡分裂的网络是更大但令人兴奋的挑战。 未来展望得益于生物化学、单丝研究和电子显微镜的进展，许多参与肌动蛋白结构的分子参与者现已充分表征，功能更好理解。利用上述工具，现在可以想象在模拟细胞内的物理化学条件下，使用有限数量的组分重建任何肌动蛋白结构，这可能有助于确定运动、内吞和分裂等关键细胞过程所需的最小成分集。然而，一个主要限制是可同时引入封闭环境的蛋白数量。除了精确移液的技术挑战外，多种蛋白的加入导致可能的浓度组合数量呈指数级增长. 《Biochemical Journal》：Reconstituted systems for studying the architecture and dynamics of actin networks |
