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近年来，活细胞分析技术的进步凸显了对能够高精度解析分子事件的生物传感工具的需求，这些工具需要具备时空保真度。结构化DNA纳米探针利用沃森-克里克碱基配对的可编程性，以单核苷酸级别的精度排列功能元件，从而实现优化的荧光读数和多重检测。它们的内在可编程性、多功能集成性和生物相容性使其成为动态细胞监测的强大平台。然而，诸如核酸酶降解和细胞内递送效率低下等问题仍阻碍着这些探针的临床应用，尤其是在细胞内生物传感和治疗领域。本文首先概述了结构化DNA纳米探针的基本设计原则，然后探讨了包括增强稳定性、提高摄取和靶向性、增强细胞内功能以及逃逸内体在内的最新细胞导向工程策略。此外，文章还回顾了过去五年中细胞内生物传感应用的进展，并讨论了操作精度和生物适应性方面的持续局限性，旨在为下一代纳米探针的合理设计提供指导。

引言

细胞内生物传感技术能够精确检测和可视化活细胞中的生物分子，为理解疾病发病机制中的分子相互作用和信号通路提供了关键见解[1]。在现有技术中，荧光成像因其非侵入性、高灵敏度和实时时空分辨率而具有显著优势[2]，非常适合用于监测核酸、蛋白质和小分子代谢物等细胞内分析物[3,4]。尽管如此，传统的细胞内探针在复杂的细胞环境中往往表现不佳。例如，单链或短寡核苷酸衍生物（如分子信标）存在结构稳定性差、报告分子与淬灭剂定位不精确以及在拥挤的细胞内环境中稳定性降低的问题[5]。为了解决这些问题，研究人员开发了结构化DNA纳米探针——这种工程化的探针将识别、报告和扩增模块整合到空间明确的DNA框架中[6]。与线性寡核苷酸探针相比，这些纳米结构具有可调的几何形状、更高的刚性和模块化功能，使得细胞内传感更加可靠和多功能[7]。

结构化DNA纳米探针具有四个基本优势。首先，其可编程性使得通过化学合成或可预测的沃森-克里克碱基配对实现功能元件的单核苷酸级定位[8]，从而优化了F?rster共振能量转移（FRET）和光诱导电子转移等检测机制的参数[9]。其次，它们的多功能集成能力允许在同一框架内同时结合识别序列、靶向配体、能量转换模块和光学报告分子，大大提高了分子碰撞效率，并支持信号放大级联反应，产生的荧光强度远超分子信标[10,11]。第三，它们坚固的框架显著增强了抗核酸酶能力，将自由寡核苷酸的降解半衰期从不到30分钟延长至活细胞中的6小时以上[12,13,14]，从而确保了操作的精确性和较长的细胞内活性。最后，它们的生物相容性和可降解性解决了生物医学应用中的安全问题，即使在100–200 nM的探针浓度下，细胞存活率通常也能保持在90%以上，显示出比传统无机或有机纳米材料更低的细胞毒性[15,16,17]。

尽管具有这些优势，但从体外到体内的转化仍受到核酸酶降解、细胞内摄取效率低下和内体隔离等生物学障碍的限制[18,19]。克服这些挑战需要多方面的工程方法，以提高DNA纳米探针的物理化学稳定性和其与复杂生物环境的兼容性。在本综述中，我们建立了一个系统框架，以理解结构化DNA纳米探针的设计原则和细胞内应用，特别强调了细胞适应性策略及其临床转化潜力——这些视角使本研究区别于以往主要关注结构配置或信号放大的综述。为了清晰起见，本文主要综合了基于细胞的研究证据，因为仅有少数系统在动物模型或临床环境中得到了验证。首先，我们根据尺寸架构对DNA纳米探针进行分类，并重点介绍了代表性结构设计。其次，我们探讨了为克服主要生物学障碍（如核酸酶降解、细胞内摄取效率低下、靶向递送、细胞内功能以及内体捕获）而开发的细胞适应性策略。第三，我们总结了过去五年中细胞内生物传感应用的进展，展示了它们在疾病诊断、分子成像和治疗整合方面的扩展能力。最后，我们讨论了与生物适应性相关的持续挑战，并概述了下一代DNA纳米探针在生物医学应用中合理设计的未来方向。

结构化DNA纳米探针的分类

结构化DNA纳米探针的操作复杂性和空间控制能力本质上取决于其尺寸架构，这些架构从一维（1D，线性）到二维（2D，平面）和三维（3D，空间）可编程设计不等，如图1所示。基于这一维度层次结构，我们接下来研究了代表性的1D、2D和3D纳米探针，以说明更高阶架构如何实现更好的空间组织和多功能性

提高稳定性

与线性单链（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）相比，结构化DNA纳米探针由于具有紧凑有序的结构而表现出更强的抗核酸酶能力[57]。核酸酶稳定性通常在生理模拟环境中进行评估，例如10%的胎牛血清（FBS），这是一种含有类似血液中核酸酶的标准细胞培养补充剂[58]。例如，DNA四面体在10% FBS中可以保持结构完整长达24小时，而单链和双链DNA则不然