肺炎链球菌RocS膜靶向序列的结构基础：染色体分离的保守膜锚定机制

正确染色体分离是所有生物体生存和增殖的基础。在大多数细菌中，这一过程由保守的ParABS系统介导。然而在人类机会性病原体肺炎链球菌中，染色体分离主要依赖于染色体分离调节因子（RocS）。值得注意的是，通常参与细菌染色体分离的其他分子伙伴（如分区蛋白ParB和凝缩蛋白SMC复合物）仍然是非必需的，而完成ParABS系统的ParA ATP酶则完全不存在于其基因组中。

RocS通过同时与染色体DNA和细胞膜的双重相互作用介导染色体分离。其N端通过螺旋-转角-螺旋（HTH）基序结合DNA，通过中央卷曲螺旋结构域寡聚化，并通过短的C末端基序锚定在膜上。与充分研究的ParB不同，尽管最近报道HTH结构域的磷酸化可调节RocS功能，但解释RocS细胞功能的结构和机制数据仍然缺乏。有证据表明，RocS与膜结合的能力对其活性至关重要。有趣的是，其短膜锚定序列与广泛保守的细胞分裂蛋白MinD的膜靶向序列（MTS）相似，提示可能存在协调分裂位点蛋白质定位的保守机制。

RocS的膜结合由其短的MTS介导，该序列对体内染色体分离至关重要。通过链球菌物种的初级序列比对，发现该序列在残基水平上高度保守。AlphaFold 3（AF3）预测的结构揭示了高度保守的HTH和卷曲螺旋结构域。有趣的是，卷曲螺旋结构域预测向C末端延伸，而包含MTS的C末端区域的pLDDT置信度得分降低。由于其电荷分布和保守性特征，该C末端片段被预测为两亲性螺旋。然而，这种对齐的膜-RocS方向似乎有悖常理，因为RocS需要同时与染色体和膜相互作用。AF3预测MTS内的pLDDT置信度得分较低，表明其结构具有可变性，可能依赖于上下文。

为了验证结构可塑性的假设，研究聚焦于一个扩展的构建体（称为RocS MTS）。溶液核磁共振（NMR）显示，RocS MTS在水溶液中是可溶且无序的。为了研究RocS MTS插入脂膜时的构象变化，研究使用了魔角旋转（MAS）固态核磁共振（ssNMR）。在接近天然的膜环境中，通过MAS ssNMR检测到保守C末端片段内Gly155和Leu160残基具有独特的刚性构象，而N末端Val149未观察到相关信号。二级化学位移分析表明，C末端Leu160呈α螺旋构象，而Gly155表现出扭结或延伸结构。动力学分析进一步证实Val149残基具有更高的流动性，而Gly155则高度固定。这些数据与RocS MTS在脂膜环境中形成以Gly155为中心的扭结-螺旋样两亲性基序一致，其N末端片段更具流动性。

为了探究扭结-螺旋基序如何在磷脂膜界面建立接触，研究采用了扩展的二维¹H-¹³C HETCOR实验。该光谱显示，在移动的脂质CH₂频率上观察到Gly Cα、Leu Cα和Leu Cγ的相关信号，证明扭结-螺旋基序插入膜表面或疏水核心。相反，Val信号在CH₂频率上缺失，表明Val149远离疏水膜核心。值得注意的是，Val Cα和Cγ在水的频率上产生强烈信号，支撑了N末端Val暴露于水而非膜核心的结论。Val149的二级化学位移分析表明其为延伸或扭结构象。

为支持MTS的膜插入及其结构可塑性，研究进行了全原子分子动力学模拟。从AF3预测的螺旋肽结构开始，模拟显示MTS逐渐插入膜单层，并与疏水酰基链建立接触。在所有重复模拟中，肽在几百纳秒内与膜结合，并在剩余的5微秒模拟中保持稳定结合。重要的是，所有模拟都显示围绕残基Gly155存在反复、瞬时的螺旋弯曲。在这种构型中，Leu160保持与膜单层疏水区域接触，而N末端Val149部分延伸至溶剂可及区域。MD结果支持了实验观察到的构象偏好和MTS与膜双层的接触。

为了研究RocS MTS对磷脂膜的影响，研究记录了²H和³¹P标记核的宽线ssNMR。检测POPC-²H₃₁酰基链的²H光谱反映了囊泡的流体层状膜相，在RocS MTS存在下得以保留。测试了两种肽：一种是缺少C末端Lys的截短变体（短RocS MTS），另一种是包含末端Lys的全长肽（RocS MTS）。两种光谱显示出相似的宽度和峰位，表明RocS MTS和短RocS MTS在膜插入过程中不改变酰基链流动性。³¹P化学位移各向异性证实了脂质囊泡的层状相。微小的³¹P信号位移表明两种RocS MTS变体与脂质头基团相互作用，改变了其化学环境，这与带正电的Lys残基与带负电的脂质头基团的直接相互作用一致。

有趣的是，在短RocS MTS存在下，复杂膜的³¹P线形显示在外磁场下的变形减小，与短RocS MTS增强膜形状一致。相反，RocS MTS诱导了一小部分尺寸减小的物体，即经历各向同性翻滚的较小膜囊泡。这种效应仅在RocS MTS中观察到，可能反映了由于额外的末端Lys导致的更强相互作用。从四极分裂推导出的酰基链局部序参数表明，在RocS MTS插入后，酰基链流动性相似，表明流体层状相得以保留。

在仅由POPC组成的囊泡中，两种RocS MTS变体均显著降低了POPC ²H双峰的宽度，表明肽对POPC膜酰基链具有 destabilizing 效应。此外，明显的各向同性中心³¹P信号表明存在大量快速翻滚的小物体（如胶束）。与此 destabilizing 效应一致，酰基链序参数显著降低，两种RocS MTS变体影响序参数直至膜中心碳。这些结果表明，与对POPC膜的影响相比，复杂的磷脂组成稳定了RocS MTS或短RocS MTS插入时的膜结构。

为了优化膜结合RocS MTS内的极化转移，样品温度在11 kHz旋转速率下从约31°C降至-1°C。出乎意料的是，在冷却过程中，二维¹³C-¹³C CP-PDSD光谱中的信号强度逐渐丧失。在12°C时，对应于Gly和Leu自旋系统的相关性仍可检测到，但强度较低；而在-1°C时，仅剩下噪声水平上的微弱非对角线信号。线宽增加可能源于先前不可见的构象变异性，动力学降低从而对化学位移分布有贡献，而明显的信号丧失表明Leu位置的肽动力学增加。

一维CP光谱显示，Leu Cα、Leu Cβ和Gly Cα信号随着温度降低而逐渐减少。相比之下，脂质酰基链的共振发生位移但保持相似强度，这是温度诱导的化学屏蔽变化的预期结果。肽信号强度的显著降低因此表明RocS MTS构象限制的丧失，这与脂质双层接近流体-凝胶相变时膜锚定丧失一致。然而，基于数据，无法明确区分动力学和弛豫差异是源于可能仍与膜结合的肽，还是肽从膜上解离。重要的是，这种效应是完全可逆的，在重新加热至31°C后初始信号强度完全恢复。

在介观尺度上，研究通过原子力显微镜观察了RocS MTS与膜的关联。使用与MAS ssNMR实验相同的脂质组成制备支撑脂双层，AFM成像证实其在添加RocS MTS前稳定性超过30分钟。观察到略微更薄的纳米域在SLB上稳定分布，相对于周围双层的高度差为0.6 +/- 0.2 nm。这些域初始直径为1.35 +/- 0.43 μm，并随时间重塑。

测试了两种肽变体：缺少C末端带正电Lys残基的短RocS MTS，和全长肽RocS MTS。两种变体的RocS MTS都优先与预形成的纳米域结合。在添加10 μM短RocS MTS后追踪膜区域，观察到膜重塑：较薄的域在孵育26分钟后变得更加突出，高度差为1.3 nm。同时，蛋白质特异性积累在较薄的域上。46分钟后，初始较低的域相对于周围膜略微突出约0.5 nm。这种行为一致地观察到，蛋白质在较薄的膜域上积累，并且域在添加短RocS MTS后17.5分钟即开始突出。反复观察到明显的簇，在孵育46分钟后达到10-20 nm的高度，平均直径为112 nm +/- 24 nm。55分钟后，一些簇达到50-60 nm的高度。

包含末端Lys的全长RocS MTS显示出与较薄纳米域相似的优先结合。值得注意的是，在10 μM或5 μM浓度下孵育RocS MTS肽导致膜快速覆盖，在10 μM下18分钟和5 μM下29分钟后即观察到蛋白质积累，表明与脂双层相互作用的倾向更强。在0.5 μM浓度下，肽选择性积累在较薄的双层域上，在孵育88分钟后形成高度为15-30 nm的簇。这些簇的平均直径为79 nm +/- 11 nm，比短RocS MTS观察到的簇小约30%。这些观察结果表明，RocS MTS在脂膜上组织成多聚簇，与RocS形成二聚体或更高阶多聚体以有效促进染色体分离的先前发现一致。

鉴于扭结-螺旋基序在体外的显著膜相互作用，研究接下来在体内验证其功能作用。通过DAPI染色分析了携带G155E点突变的突变株，以野生型和ΔrocS株作为对照。如预期，99%的WT细胞显示有效的染色体分离，而20%的ΔrocS细胞是无核的，反映了有缺陷的分离。值得注意的是，将Gly155突变为带负电的Glu也导致有缺陷的分离，7%的细胞是无核的。一致地，ΔrocS和rocS_G155E菌株的细胞面积减小，表明Gly155影响RocS在染色体分离期间的功能，支撑其在膜靶向过程中的主要作用。支持这一点的是，与RocS-GFP相比，RocSG155E-GFP的细胞定位发生强烈改变。这种表型可能源于扭结-螺旋构象的扰动、在扭结位置引入的负电荷或两者的组合效应。

鉴于单个残基的强烈效应，研究假设ΔrocS和G155E突变可能也影响膜脂稳态。通过监测FM4-64掺入测试了这一点，FM4-64是一种靶向膜疏水核心的两亲性染料。与WT细胞相比，ΔrocS细胞中的FM4-64荧光减少，表明膜脂含量改变，暗示促进FM4-64掺入的带负电磷脂水平降低。在rocS_G155E细胞中观察到类似的减少，证明扰动Gly155类似地调节膜特性。然而，当前数据无法区分膜组成的变化与单独膜结构的变化。

RocS蛋白家族的预测结构表明存在保守的延伸螺旋，尽管在链球菌细胞周期中协调膜结合和染色体分离需要结构可塑性。先前提出RocS在分裂位点附近锚定在膜上，在那里它同时与染色体和膜相互作用。随着细胞分裂的进行，RocS与OriC区域一起迁移，保持与核体和膜的双重相互作用。先前的观察也证明二聚体或更高阶多聚体形成对RocS功能至关重要。因此研究假设，一个特定的结构元件，不同于连续螺旋，将膜靶向序列与寡聚化卷曲螺旋结构域连接起来。

为了验证这一假设，研究使用MAS ssNMR分析了重建到磷脂囊泡中的RocS MTS，揭示了高度保守的Gly155（提议为两亲性螺旋的一部分，位于RocS MTS N末端的两个Lys残基附近）在膜关联时可以采用扭结构象。该扭结之后立即是C末端两亲性基序，如疏水Leu160残基的明确螺旋构象所证明。扭结-螺旋基序仅在RocS MTS与膜表面相互作用时形成，在溶液中保持无序，正如先前对分离的两亲性螺旋的报道。与螺旋基序相反，RocS MTS的N末端区域（以Val149为代表）在微秒时间尺度上保持柔性。

利用MAS ssNMR探测直接酰基链-肽相互作用，研究表明扭结-螺旋基序至少部分与疏水膜接触，如平衡的H-H自旋扩散所证明。结合从直接脉冲¹³C检测光谱对RocS MTS动力学的分析，数据支持一个模型，其中Leu侧链可能向疏水膜区域延伸，采用与酰基链相当的灵活性。

在确定膜上RocS MTS的构象后，研究接下来检查膜物理状态的变化如何影响其构象和动力学。降低温度有效地改变了接近流体-凝胶相变的膜脂环境，如通过MAS ssNMR对脂质CH₂信号的监测所示，而没有冻结柔性N末端RocS MTS的分子运动。有趣的是，温度梯度导致RocS MTS的MAS ssNMR信号强度显著降低，表明膜结合肽可能部分从膜上解离，从而失去其扭结-螺旋构象。然而，不能排除肽仍与膜结合，表现出不同的动力学。由于这种结构丧失在温度恢复至初始值时是可逆的，因此推断膜的流体相在促进MTS-膜相互作用中起关键作用。

宽线NMR进一步证实扭结-螺旋基序与脂双层相互作用而不扰动复杂磷脂膜的层状相。这些发现证实了一个模型，其中RocS MTS定位于膜表面，Leu侧链插入双层的疏水区域，同时保持膜的整体有序性和稳定性。相反，在简单的POPC囊泡中，RocS MTS destabilized 膜，导致小物体的形成，反映了两亲性螺旋常见的破坏潜力。因此数据揭示，细菌膜的复杂磷脂组成稳定了RocS MTS插入，防止大规模膜无序效应并保持双层完整性。

为了检查RocS MTS在膜表面的结构组织如何转化为更大尺度的膜相互作用，研究进行了实时AFM成像，揭示了在POPC:POPG:POPA:CL膜双层中稳定形成更薄的脂质纳米域，表明流动性增加。RocS MTS扭结-螺旋基序有效地与这些预形成的纳米域结合，形成80 nm宽的簇，对于短RocS MTS生长至>100 nm，在大约1小时后保持恒定大小，让人想起体内观察到的焦点。值得注意的是，部分带正电的C末端残基增强了螺旋的两亲性特征，显著增强了扭结-螺旋基序与SLB相互作用的倾向。两亲性螺旋在细胞中广泛分布，用于将外周膜蛋白靶向特定膜，通常作为曲率传感器，例如充分研究的长α-突触核蛋白。与α-突触核蛋白相比，RocS扭结-螺旋基序短（约10个残基）但类似地携带正净电荷。与一般原理一致，含有两亲性螺旋的蛋白质由于更容易插入脂双层，优先结合复杂膜中流动性增加的区域。结果表明，RocS扭结-螺旋MTS优先与更薄的脂质纳米域结合。考虑到所使用的CL的结构特征，包括脂质形状、头基大小和每个酰基链的两个不饱和度，可以预期CL比具有相同酰基链但更大头基的POPC和POPG更低。富含CL的较低域因此与其大小和形状以及低T_m（< -20 °C）一致。因为心磷脂还参与细菌细胞分裂位点选择并在体内和体外形成RIF，研究提出RocS扭结-螺旋MTS可以介导与富含CL的流体纳米域的关联。考虑到此处研究膜中CL含量相对较低（5%），进一步推测这些纳米域通常可能含有更高比例的去阴离子脂质。

重要的是，体内验证反映了这些体外发现。扰动MTS内保守Gly155残介导的结构可塑性导致染色体分离缺陷，甚至比删除基本伙伴ParB引起的缺陷更严重，强调了Gly155扭结在RocS功能中的核心作用。这种突变在RocS、扭结基序和肺炎链球菌的膜脂组成之间建立了直接联系。干扰RocS功能改变了膜组织，如在ΔrocS和rocS_G155E细胞中观察到的类似膜特性调节所示。这些数据表明，肺炎链球菌补偿了RocS的缺失或其改变的膜靶向机制，加强了RocS扭结-螺旋基序与膜稳态之间的功能耦合。

总之，研究揭示了保守的RocS MTS采用扭结-螺旋构象，该构象与流体膜区域中的脂双层强烈相互作用，在膜关联和正确蛋白质功能中起关键作用。值得注意的是，在包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在内的细菌物种中广泛存在的细胞分裂位点定位蛋白MinD也具有类似的保守MTS。超越细菌，相关序列在所有生命领域中的存在表明，扭结-螺旋基序代表了一个介导特异性脂质相互作用和空间调节的基本结构模块。这些发现为未来研究脂质-蛋白质相互作用控制细菌细胞分裂和其他基本细胞过程的分子机制铺平了道路。