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对光杆菌（Photorhabdus）毒力盒（PVC）信号肽的进一步筛选和分析揭示了一种具有抗吞噬作用的效应因子摘要作为典型的细胞外收缩性注射系统（eCISs）之一，Photorhabdus 毒力盒（PVC）可以从细菌细胞中释放出来并注入真核细胞中，而信号肽（SPs）则指导异源蛋白质装载到PVC中，这使得PVC成为体外蛋白质递送的理想模型。在本研究中，测试了64个基因的N端序列（NTSs）的装载效果，其中45个NTSs被验证为SPs。序列分析显示，亲水性的NTSs更有可能引导货物装载，这可能是由于它们与PVC15 ATP酶的相互作用。此外，通过SPs的鉴定，发现了一种未分类的效应蛋白Photorhabdus asymbiotica抗吞噬蛋白（PAAP）。当通过PVC将其递送到J774A.1小鼠巨噬细胞中时，观察到显著的细胞圆化现象。而且，在PVC-PAAP处理后，巨噬细胞对细菌的吞噬活性显著降低。转录组分析和Western blotting分析表明，Klf2、RhoB、Tsc22d3和Ezr基因的上调，以及P21-激活激酶（PAK）表达的减少，可能导致细胞骨架变化和吞噬作用下降。总之，这项研究扩展了PVC的SPs范围，阐明了SPs与nSPs之间的物理化学性质差异，并鉴定了一种新的PVC效应蛋白及其在细胞形态和吞噬作用中的生物学功能。 引言分泌系统是细菌用来将蛋白质或核酸递送到细胞外空间或其他真核和原核细胞中的蛋白质复合物。它们在细菌中广泛存在，对细菌的各种生理活动至关重要，如生存、种间竞争和交流，以及与宿主的相互作用[1]，[2]。 收缩性注射系统（CISs）是一种细菌分泌系统，代表了由细菌基因组中的各种噬菌体尾相关结构编码的类型。根据其作用机制，它们可以分为细胞内收缩性注射系统和细胞外收缩性注射系统（eCISs）[3]。后者是类似噬菌体尾部的收缩装置，在细胞质中组装，并可能在细菌细胞裂解时释放和激活[4]。eCISs可以通过其尾纤维蛋白与目标细胞表面结合，收缩并刺穿目标细胞[4]，[5]。 根据功能，eCISs可以分为两类：针对细菌的噬菌体尾部样细菌素（PTLBs或tailocins）和针对真核细胞的噬菌体样蛋白质转运结构（PLTSs）[6]，[7]。PTLBs的例子包括R型pyocin，存在于革兰氏阴性Pseudomonas aeruginosa（P. asymbiotica）和革兰氏阳性Listeria monocytogenes中[2]，[8]，[9]，[10]，[11]。它们能够穿透并杀死同一物种的其他细菌菌株，使产生它们的细菌在生长中具有竞争优势[10]，[12]。代表性的PLTSs包括在Pseudoalteromonas luteoviolacea中发现的变形相关收缩结构（MAC）、在Serratia entomophila中发现的抗摄食噬菌体（Afp）以及在P. asymbiotica中鉴定出的Photorhabdus毒力盒（PVC）[13]，[14]，[15]。AFP、MAC和PVC都能够装载有毒效应蛋白，使它们能够杀死真核细胞[16]，[17]，[18]，[19]，[20]。有证据表明PLTSs也针对细菌，因为其中一些使用噬菌体的抗菌毒素和尾纤维[21]，[22]。 此前已经分析了PVC的整体结构。PVC的整体结构由四个主要部分（鞘、管、基板和刺以及尾纤维）组成[15]。PVC成为体外蛋白质递送的理想模型，因为它具有宽敞的内腔，并且可以释放到细菌细胞外部进行刺穿反应[23]。此外，PVC通过尾纤维识别细胞，这些尾纤维可能在收缩前附着在目标细胞上，类似于其进化来源的噬菌体。先前的研究表明，通过修改PVC尾纤维蛋白的识别区域并附加特定的配体蛋白，可以设计PVC以识别相应的受体蛋白，从而实现精确的细胞靶向[24]。 先前的研究还鉴定出了两种效应蛋白Pdp1和Pnf，它们由PVC操纵子下游的基因编码。研究证实这些效应蛋白可以装载到PVC中，并进一步递送到J774A.1小鼠巨噬细胞中以实现毒性[19]，[20]。此外，通过鉴定Pdp1和Pnf的N端，获得了两种信号肽（SPs）。这些SPs在与抗癌蛋白或具有各种生化性质（长度、电荷）的外源蛋白的N端融合后，可以引导这些蛋白装载到PVC中，从而将其递送到细胞内[23]。 SPs的发现为PVC和效应蛋白之间的相互识别建立了桥梁，并促进了效应蛋白有效装载到PVC颗粒中。然而，目前尚不清楚是否存在其他SPs以及它们如何指导效应蛋白装载到PVC中。为了研究其他SPs的存在及其指导效应蛋白装载到PVC中的机制，本研究测试了位于PVC基因簇上游和下游的一系列基因的N端序列（NTSs），分析了装载能力，并探讨了SPs的特性。同时，通过SPs的鉴定，本研究进一步鉴定出一种新的PVC效应蛋白Photorhabdus asymbiotica抗吞噬蛋白（PAAP）。这种未分类的效应蛋白存在于大量细菌中，具有抑制巨噬细胞吞噬能力的作用。 部分片段SPs的扩展筛选P. asymbiotica ATCC 43949的基因组编码五个 讨论此前只鉴定出了两种PVC SPs，它们都属于PVC效应蛋白[23]。在本研究中，选择了五个PVC簇中编码可能具有细胞外功能的蛋白质的64个NTSs，这些蛋白质具有细胞毒性等活性。通过分析这些NTSs，鉴定出45个SPs序列，其中16个SPs表现出强烈的装载效率。这表明在 细菌菌株和细胞系使用E. coli EPI300进行PVC的生产和纯化，使用E. coli DH5α进行质粒构建。本研究中使用的抗生素及其最终浓度如下：氨苄西林，100 μg/mL；四环素，10 μg/mL；庆大霉素，20 μg/mL。J774A.1小鼠巨噬细胞系和HeLa细胞系在添加了10%胎牛血清（Gibco）和链霉素-青霉素（Invitrogen）的Dulbecco's改良Eagle培养基中培养。 |
