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融解曲线中那些令你头疼的问题，全面解析看这里！融解曲线中那些令你头疼的问题，全面解析看这里！ 我们在做染料法 SYBR Green qPCR时，除了要看扩增曲线的CT值大小外，另一个重要的指标是融解曲线是否为单峰。那您知道融解曲线是怎么来的吗？为什么说它是染料法 SYBR Green qPCR的重要指标之一呢？我们现在就来一起了解一下。 01，什么是融解曲线 要明确融解曲线的重要性，我们需要先知道染料法 SYBR Green qPCR的化学原理。 染料法 SYBR Green qPCR的体系中添加了一种DNA双链小沟结合染料, 即SYBR Green。它与DNA结合时发光，游离时不发光，所以每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去，就会产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。 但是SYBR Green 只是识别DNA 双链的小沟结构，当qPCR体系中存在非特异性产物时，SYBR Green 同样可以和这些非特异性产物的DNA双链结合发出荧光。所以仪器检测到的荧光值其实为qPCR目的产物与非特异性产物荧光值的总和，那得到的CT值自然是不准确的了。所以使用染料法qPCR，前提为qPCR扩增体系一定要特异。
qPCR扩增结束后，将温度逐渐升高至95℃，DNA双链也逐步解离为单链，DNA小沟结构逐步消失，SYBR Green 从双链中游离出来，荧光值降低。当温度达到 DNA 解链一半的温度时，也就是 Tm 值时，SYBR Green 会大量游离出来，荧光强度随之会出现突然下降，直至为0。这个反应荧光值变化的曲线即为融解曲线。
以ABI Q3软件的融解曲线程序设置为例（参见上图）：所有的DNA单链在60℃下完全退火形成双链后，温度逐渐升高至95℃（升温速度为0.15℃/sec），DNA双链逐渐解链为单链。仪器检测到该过程荧光信号的改变，即可得到融解曲线的荧光图谱。
逐渐升温至95℃过程中，双链逐渐打开，荧光值高度下降 上图为扩增曲线与融解曲线的原始图谱，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光值。前40个循环即为扩增曲线，40个循环之后为融解曲线。可以看到随着循环数增加，荧光值逐渐下降，当到达Tm值时，剩余双链迅速解开，荧光值迅速降低至0。 但我们平时看到的融解曲线是下面的这张图谱。它是由融解曲线原始图谱上每个点取负倒数而得到的。其横坐标表示温度，最高峰值对应的横坐标的温度值，即为Tm值。如我们图中所示的融解曲线的Tm值为87℃。
02，融解曲线的作用是什么 融解曲线的Tm值是融解曲线中的重要参数，在使用同一qPCR试剂下，目标基因融解曲线的Tm值是由其产物长度与GC含量决定的。目标基因的qPCR产物长度越长、GC含量越高，Tm值越大。不同的qPCR产物因其长度与GC含量不同，它们的Tm值大小也不一样。 如下图所示，基因1 qPCR产物长度较基因2 qPCR产物短，那融解曲线表现出基因1的Tm值低于基因2的Tm值。
同理，如果qPCR扩增体系不特异，出现一个非特异性扩增产物，那qPCR产物即由目的产物与非特异性产物共同构成，因两者长度与GC含量不同，在融解曲线上会表现出两个Tm值，即两个波峰；若非特异性产物Tm值与目的条带的Tm值接近，融解曲线可能出现宽峰。
例2：杂峰/宽峰-qPCR产物不单一
所以，通过判断基因的融解曲线峰形是否为单一窄峰，即可判定该基因qPCR扩增体系是否特异。染料法荧光定量，基因的融解曲线必须为单峰，定量结果才为准确。 03，如何去除融解曲线的杂峰 ① 引物：如果引物设计不优，如引物设计软件得出的引物评分较低、引物扩增效率不满足90-110%，主要原因可能是引物本身质量不佳导致体系出现非特异性扩增。 解决方案： 重新设计引物，选择引物设计软件评分较高的2-3对引物进行合成，之后选择融解曲线无杂峰，扩增效率满足90-110%，且最接近100%的引物作为该基因的引物。 若该杂峰为引物二聚体引起，适当降低引物的投入量可以有效抑制引物二聚体的产生。 ② 模板：cDNA模板存在基因组污染。 解决方案： 设计跨内含子引物进而避免基因组污染带来的干扰；或者选用带有基因组清除的逆转录试剂盒，逆转录前对RNA中混有的基因组进行清除。 ③ CT值偏大：CT值≥30，可能是由于基因本身表达量低、或者扩增效率不满足90-110%而导致的基因CT值偏大。CT值较大的情况下，融解曲线容易出现杂峰。 解决方案： 如果基因扩增效率不满足90-110%，需要重新设计引物。 如果引物扩增效率满足90-110%，操作无问题的前提下，CT值≥30，说明基因本身的表达量很低，可以适当增加模板的投入量，若没有改善，可以更换为探针法。 |
