(六) 发光鉴定

 一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1．HRP-ECL发光法：

             将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2．AP-NBT/BICP显色法：

           每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。

(七) NC膜的多次使用

          一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。

           如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。

             如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用 strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

             对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

注意事项增强敏感性，若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1）用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2）将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3）封闭40~60min一抗杂交，室温1h。

4）37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

5）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6）二抗杂交，37℃ 1h。

7）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8）发光鉴定。

9）若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10）三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11）PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

12）发光鉴定。一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）