牛和羊呼吸道疫病通常由多种细菌性病原体混合感染引起，主要靶标包括牛支原体（Mycoplasma bovis，Mb）、绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，Mh）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）及牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，Tb）。其中Mb与Mo分别为牛、羊支原体肺炎的核心致病原。基于此病原谱差异，研究人员建立了两套分别针对牛、羊的多重PCR（multiplex PCR）检测体系，核心差异为支原体属引物设计。牛源体系可同步检测Mb、Mh、Pm、Tb，羊源体系可同步检测Mo、Mh、Pm、Tb，预期扩增片段大小依次为319/320 bp、390 bp、528 bp、274 bp。经反应条件优化后，两套体系均可实现靶标病原体的同步检测，特异性、灵敏度与重复性良好，牛源体系检测限为1.0×103copies/μL，羊源体系检测限为1.0×102–103copies/μL。临床样本初步验证显示，该体系可有效检出靶标细菌病原体。结果表明，所建立的多重PCR体系可为牛、羊细菌性呼吸道病原体的进一步验证及潜在临床应用提供方法学基础。

牛和羊呼吸道疫病是全球畜牧业面临的重大健康威胁，典型临床症状包括发热、咳嗽与呼吸困难。此类疾病病原组成复杂，涵盖细菌、病毒等多种微生物，其中细菌性病原体的精准检测对指导抗菌治疗与疫病防控策略制定尤为关键。牛呼吸道疫病主要由Mb、Mh、Pm、Tb驱动，羊呼吸道疫病则主要与Mo、Mh、Pm、Tb相关。全球范围内该类疾病发病率与死亡率居高不下，每年造成的经济损失可达300亿美元，流行病学数据显示超过半数的牛、羊疫病为呼吸道类型，2–6月龄动物易感性最高，发病率可达30%–80%，死亡率可达10%–35%。传统诊断方法如细菌分离培养、血清学检测与临床观察存在耗时长、操作繁琐、灵敏度有限等缺陷，普通PCR虽具备高灵敏度与特异性，但多聚焦单一病原，难以满足混合感染的快速诊断需求。因此研究人员开发了可同步检测牛、羊常见细菌性呼吸道病原体的多重PCR体系，以提升临床诊断效率。

参考菌株包括Mo（Y98）、Mh（DSM 5283）、Pm（CCUG 35587），由甘肃农业大学动物医学院保存；Mb（08M）与Tb（ATCC 19210）基因组DNA由兰州兽医研究所兽医微生物学实验室提供。干扰病原体包括肠炎沙门菌（DK6）、大肠杆菌（ATCC 8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、无乳链球菌（ATCC 13813）及牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）、牛腺病毒3型（BAdV3），均由甘肃农业大学动物医学院保存。

采用Fast Pure Bacteria DNA Isolation Mini Kit-BOX 2（Vazyme，中国）提取Mo、Mh、Pm基因组DNA，使用NanoDrop-2000（Thermo Fisher NanoDrop，美国）测定浓度，-20°C保存备用。

从NCBI数据库下载5种靶标病原体的基因组序列，通过泛基因组分析筛选核心基因，针对Mb的ftsH基因、Mo的P80基因、Mh的pepS6基因、Pm的lon基因、Tb的pks2基因设计特异性PCR引物并合成。

将Mb、Mo、Mh、Pm、Tb DNA样本分别稀释至1 ng/μL作为模板储备液，经10倍梯度稀释后用于体系优化与性能评价，包含单一病原模板、混合病原模板及阴性对照。

以ParaOpt 1–5为模板，ddH₂O为阴性对照，使用2×Taq Master Mix（TaKaRa，中国）进行单重PCR扩增。20 μL反应体系包含10 μL 2×Taq Master Mix、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、模板1 μL、ddH₂O 7 μL。扩增程序为：94°C预变性5 min；98°C变性10 s、56°C退火30 s、72°C延伸50 s，共30个循环；72°C终延伸5 min。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳（120 V）检测，紫外凝胶成像系统观察结果，并对扩增产物测序后在NCBI网站进行BLAST比对验证。

分别对退火温度（45°C–65°C梯度）、延伸时间（10–40 s，间隔10 s）、引物浓度进行优化，通过核酸电泳观察目标条带的清晰度与特异性确定最优反应参数。

以5种靶标细菌核酸为模板，ddH₂O为阴性对照，8种干扰病原体核酸为对照，按优化后的多重PCR体系与条件进行扩增，验证体系的特异性。

构建Mb、Mo、Mh、Pm、Tb的重组质粒标准品pMD^TM-T-ftsH、pMD^TM-T-P80、pMD^TM-T-pepS6、pMD^TM-T-lon、pMD^TM-T-pks2，等量混合后按1.0×10⁹copies/μL至1.0×10⁰copies/μL进行10倍梯度稀释，使用优化的多重PCR体系进行检测，确定检测限。

以优化的混合质粒标准品为模板，进行批内重复性（同批次模板相同条件下重复扩增3次）与批间重复性（3个不同批次混合质粒标准品相同条件下扩增）试验，通过电泳条带一致性评估体系重复性。

从甘肃省多个规模化养殖场采集200份鼻拭子样本（牛、羊各100份），-80°C保存，分别使用建立的牛、羊多重PCR体系进行检测，验证其临床检测性能。

单重PCR结果显示所有引物对均扩增出与预期大小一致的清晰条带，无非特异性扩增，测序结果与对应靶标病原体参考序列完全一致，引物特异性良好。在此基础上成功建立两套多重PCR体系：牛呼吸道体系靶向Mb、Mh、Pm、Tb，羊呼吸道体系靶向Mo、Mh、Pm、Tb。优化后反应体系为20 μL，含10 μL 2×Taq Master Mix、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、模板1 μL，补足ddH₂O至20 μL；反应条件为94°C预变性5 min，98°C变性10 s、63°C退火30 s、72°C延伸20 s（30个循环），72°C终延伸5 min。两套体系均能扩增出与预期大小一致的清晰条带，无交叉反应与非特异性扩增，可实现4种靶标病原体的同步区分检测。

特异性验证结果显示，仅靶标病原体Mb、Mo、Mh、Pm、Tb出现与预期大小一致的特异性扩增条带，8种干扰病原体及阴性对照均无扩增信号，牛、羊两套体系均无可见交叉反应，结合全基因组序列的生物信息学分析进一步支持引物的特异性。

牛呼吸道多重PCR体系对4种靶标重组质粒的检测限均为1.0×10³copies/μL；羊呼吸道多重PCR体系对pepS6与lon重组质粒的检测限为1.0×10²copies/μL，对P80与pks2重组质粒的检测限为1.0×10³copies/μL，表明体系可在低模板浓度下稳定检出靶标病原体。

批内重复性试验中，同一混合质粒标准品在相同条件下重复扩增3次，靶标条带大小与亮度一致，无非特异扩增与漏检；批间重复性试验中，3个不同批次混合质粒标准品在相同条件下扩增，条带模式稳定，所有靶标片段均能可靠扩增，表明两套体系均具有良好的重复性，扩增性能稳定。

牛临床样本检测中，61份样本至少检出1种靶标病原体，Pm检出率最高；61份阳性样本中50.8%为混合感染，其中双重感染占31.2%（以“Pm+Mh”组合最常见，占63.2%），三重感染占13.1%，四重感染占6.6%；多重PCR检测结果与单重PCR完全一致，阳性样本数相同。羊临床样本检测中，75份样本至少检出1种靶标病原体，Mh检出率最高；75份阳性样本中42.7%为混合感染，其中双重感染占26.7%，三重感染占16.0%；多重PCR与单重PCR检测结果一致，阳性样本数相同。

牛和羊产业是全球畜牧业的重要组成部分，呼吸道疫病因高流行率、病原复杂性成为产业发展的主要制约因素，快速精准的病原体检测是临床有效管控的核心。牛、羊呼吸道疫病常以细菌、病毒、支原体混合感染形式存在，临床症状重叠，其中细菌性病原体的鉴定对指导抗菌治疗尤为关键。本研究建立的两套多重PCR体系可单次反应同步检测4种常见细菌性呼吸道病原体，相比单靶标PCR显著提升了诊断效率。所选靶标基因ftsH、P80、pepS6、lon、pks2在实验验证与序列分析中均表现出高特异性，针对Mh的引物通过序列比对可有效区分曼氏杆菌属近缘物种，且无与非靶标病原的交叉反应。灵敏度分析显示检测限为1.0×10²–1.0×10³copies/μL，与普通多重PCR报道水平相当，可满足实验室检测需求，不同靶标检测限的差异可能与引物效率或多重体系中的扩增竞争有关。重复性试验证实体系在不同批次与重复实验中扩增模式一致，临床样本检测中多重PCR与单重PCR结果完全吻合，且混合感染比例较高，与牛、羊呼吸道疫病的流行病学特征相符。研究仍存在一定局限性：临床验证规模有限，未与已建立的参考方法进行对比；样本质量、核酸提取效率、病原载量等因素可能影响检测性能；多重体系中引物间的潜在相互作用可能降低部分靶标的扩增效率。综上，本研究建立的两套多重PCR体系在测试条件下表现出良好的特异性、灵敏度与重复性，可作为实验室检测工具，后续需扩大样本量并开展全面验证以确认其临床适用性。