摘要：鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）引起慢性呼吸道疾病，其原因被认为与其逃避感染禽类免疫应答的能力有关。该病原体携带多个编码支原体免疫球蛋白结合-蛋白酶（mycoplasma immunoglobulin binding-protease，MIB-MIP）系统基因的拷贝，该系统能够结合并切割禽类免疫球蛋白（immunoglobulins，Igs），同时还编码生殖支原体（M. genitalium）和肺炎支原体（M. pneumoniae）的Ig结合蛋白-M（Ig-binding Protein-M）同源物以及滑液支原体（M. synoviae）的Ig切割蛋白酶CysP同源物。然而，这些同源物之间的相互作用、其宿主特异性以及它们与MIB-MIP系统的协同关系尚未明确。本研究中，研究人员将MG中的假定Protein-M和CysP表达为重组谷胱甘肽S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）融合蛋白，进行了功能鉴定，并检测了它们与不同MIB-MIP系统组分的相互作用，以及它们对MG抗体依赖性补体介导杀伤的影响。GST-Protein-M能够结合禽类和哺乳动物免疫球蛋白，但不与MIP蛋白酶相互作用。GST-CysP选择性切割游离鸡IgY以及与GST-MIB或GST-Protein-M结合的IgY。GST-Protein-M、GST-CysP和GST-MIB-MIP蛋白均能结合ATP，但只有GST-CysP具有ATP酶活性。MG感染鸡的血清中含有针对部分MIP蛋白的抗体，但不存在针对Protein-M或CysP的抗体。兔抗MG抗体增强补体介导杀伤MG的能力被GST-MIB-MIP和GST-Protein-M抑制。GST-CysP不能切割兔IgG，且在抗体依赖性补体介导杀伤试验中无显著影响。总之，这些发现证实Protein-M和CysP作为额外的Ig靶向系统，与MIB-MIP系统一起通过不同但互补的机制发挥作用，增强了这一重要病原体的免疫逃避和持续感染能力。
论文解读：
鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）是引起鸡慢性呼吸道疾病和火鸡传染性鼻窦炎的重要病原体，具有显著的临床和经济意义。支原体基因组精简，缺乏细胞壁，依赖宿主生存，但其能在宿主免疫应答压力下长期持续感染，这一能力部分归因于其多种免疫逃逸策略。以往研究表明，MG携带多个拷贝的支原体免疫球蛋白结合-蛋白酶（MIB-MIP）系统基因，该系统能结合并切割禽类免疫球蛋白（Igs）；同时，MG基因组中还编码生殖支原体（M. genitalium）和肺炎支原体（M. pneumoniae）免疫球蛋白结合蛋白Protein-M的同源物，以及滑液支原体（M. synoviae）免疫球蛋白切割蛋白酶CysP的同源物。然而，这些同源物的确切功能、宿主特异性及其与MIB-MIP系统的相互作用此前尚未明确。为此，研究人员对MG中的假定Protein-M和CysP进行了功能鉴定，并探讨了它们与MIB-MIP系统的相互关系及其对抗体依赖性补体介导杀伤的影响。
研究人员将MG的假定Protein-M和CysP表达为重组谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，通过体外功能实验分析了其免疫球蛋白结合和切割活性、ATP结合与水解能力、免疫原性，以及对抗体依赖性补体介导杀伤的影响。研究发现，Protein-M具有广泛的免疫球蛋白结合谱，可结合禽类和哺乳动物的IgY、IgM和IgA；CysP则特异性切割鸡IgY，而对其他禽类和哺乳动物免疫球蛋白无活性。两种蛋白均不与MIP蛋白酶直接相互作用，但CysP能够切割与Protein-M或MIB蛋白结合的鸡IgY。所有被测蛋白均能结合ATP，但仅CysP具有可检测的ATP酶活性。此外，MG感染鸡血清中存在针对部分MIP蛋白的抗体，但未检测到针对Protein-M或CysP的抗体。在补体杀伤试验中，GST-MIB-MIP和GST-Protein-M均抑制了兔抗MG抗体增强的补体介导杀伤，而GST-CysP单独存在时无明显抑制作用。这些结果确立了Protein-M和CysP作为MG中额外的Ig靶向系统，与MIB-MIP系统通过不同但互补的机制共同增强免疫逃逸和病原体持续存在。
关键技术方法方面，研究人员首先利用BLASTX、DeepTMHMM、HHpred等生物信息学工具对Protein-M和CysP进行了同源性和结构预测，随后将编码序列克隆至pGEX-4T-1载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并亲和纯化GST融合蛋白。功能实验包括免疫球蛋白结合试验、免疫球蛋白切割试验、ATP-琼脂糖下拉试验、ATPase/GTPase活性测定、Western blot免疫反应性分析以及体外补体介导杀伤抑制试验。样本来源方面，使用了无特定病原体（SPF）白来航鸡的血清，这些鸡在8周龄时通过雾化感染MG Ap3AS株，2周后采集血液；同时使用未感染鸡血清作为对照。另外，多种禽类和哺乳动物血清来自墨尔本大学亚太动物健康中心等提供的现有样本，兔抗MG全细胞裂解液多克隆血清来自实验室现有收集。
研究结果部分，各小标题所对应的发现如下：
**鸡毒支原体的Protein-M和CysP**：通过基因组分析，Protein-M同源物（F9C22_03005）和CysP同源物（F9C22_02750）位于MG菌株Ap3AS基因组中彼此远离的位点，且均与MIB-MIP基因簇分隔。Protein-M包含与生殖支原体MG_281类似的富亮氨酸Protein-M TD基序，预测为细胞表面表达的膜蛋白；CysP包含木瓜蛋白酶样C1肽酶结构域和凝集素样超家族结构域，预测具有信号肽、胞外结构域、跨膜螺旋和短胞质尾。两种蛋白在MG菌株间高度保守，CysP与滑液支原体CysP有≥90%的氨基酸相似性。
**鸡毒支原体的Protein-M结合禽类和哺乳动物免疫球蛋白**：通过将GST-Protein-M与稀释的鸡血清孵育后亲和纯化，SDS-PAGE和Western blot显示其结合鸡IgY重链和轻链，同时结合鸡IgM和IgA。结合试验还表明，GST-Protein-M能够结合火鸡、鸭、雉鸡等禽类血清中的IgY、IgM、IgA，以及山羊、绵羊、兔、马、猪和沙袋鼠等哺乳动物血清中的IgM、IgG和IgA。
**MIP蛋白酶不与Protein-M-IgY复合物相互作用**：将Protein-M-IgY复合物与纯化的重组GST-MIP蛋白共同孵育后，Western blot显示IgY重链保持完整，表明MIP蛋白酶无法切割与Protein-M结合的IgY。
**鸡毒支原体CysP对鸡IgY具有特异性，并切割与Protein-M和MIB蛋白结合的IgY**：将GST-CysP与鸡血清孵育后，Western blot检测到鸡IgY重链被切割为约40–45 kDa的片段，而IgM和IgA重链不受影响。在与其他禽类和哺乳动物血清的实验中未检测到IgY或IgG切割，表明CysP对鸡IgY具有特异性。GST-CysP还能切割与GST-Protein-M或GST-MIB3940结合的鸡IgY重链。
**MIB、MIP、Protein-M和CysP蛋白均结合ATP，但仅CysP具有可检测的ATP酶活性**：ATP-琼脂糖下拉实验显示GST-MIB3940、GST-MIP3865、GST-Protein-M和GST-CysP均能结合ATP。ATPase活性测定中，仅GST-CysP检测到ATP水解活性，且在单独存在、与游离IgY或IgY结合蛋白组合时均有活性，而其他蛋白和阴性对照无活性。
**MG感染鸡血清抗体与MIB-MIP、Protein-M或CysP蛋白的反应性**：Western blot分析显示，MG感染鸡血清与GST-MIP3920和GST-MIP3865有反应，但与GST-MIP3660无反应；与GST-Protein-M和GST-CysP均无反应。未感染鸡血清与所有GST-MIB蛋白均发生反应，感染鸡血清也与所有GST-MIB蛋白反应，提示MIB蛋白具有免疫球蛋白结合活性。
**Ig结合和Ig切割对Ig依赖性补体介导杀伤鸡毒支原体的影响**：补体杀伤试验中，单独加入兔抗MG血清和补体可显著降低MG活菌滴度；加入GST-MIB、GST-MIB-MIP或GST-Protein-M后，补体介导杀伤被显著抑制，存活滴度与仅补体处理组相当。单独加入GST-CysP不抑制杀伤，但当GST-CysP与GST-Protein-M或GST-MIB联合加入时，杀伤也被抑制至类似水平。
讨论部分指出，MG的Protein-M与人类支原体中的同源物序列差异较大，但保留了富亮氨酸重复结构，且仅在肺原体系统发育簇的支原体物种中存在。Protein-M的广谱免疫球蛋白结合活性可能通过封闭抗原-抗体结合而干扰体液免疫；CysP对鸡IgY的特异性切割则表明其适应于逃避鸡的IgY应答。MIB-MIP系统和Protein-M可抑制抗体依赖性补体介导杀伤，而CysP可能通过切割鸡IgY去除补体激活区域，但在本研究中无法用哺乳动物补体系统验证。感染鸡血清中缺乏针对Protein-M和CysP的抗体，提示这些蛋白可能免疫原性较弱或在感染中差异表达。所有三种系统蛋白均能结合ATP，且CysP具有内在ATP酶活性，提示ATP水解可能参与这些系统在体内的功能。
研究结论部分可翻译为：总之，这项研究通过鉴定Protein-M和CysP作为两种额外的靶向免疫球蛋白的蛋白，扩展了对鸡毒支原体免疫逃逸的理解，它们可独立于MIB-MIP系统发挥作用。Protein-M在禽类和哺乳动物物种中表现出广泛的免疫球蛋白结合活性，而CysP仅切割鸡IgY，表明其适应于特异性干扰鸡的免疫应答。尽管这三种系统在体外可独立发挥作用，但它们在体内的潜在协同或竞争性相互作用以及感染期间的表达仍有待探索。Protein-M和MIB-MIP蛋白均能在体外削弱抗体依赖性补体介导杀伤，凸显了它们破坏体液免疫关键效应机制的能力。三个系统蛋白均能结合ATP，以及CysP的内在ATP酶活性，提示ATP水解可能参与这些系统在体内的功能。总体而言，这些发现凸显了鸡毒支原体与其宿主之间相互作用的复杂性，并强调需要进一步研究支原体采用的多种不同免疫逃逸策略之间的相互作用，同时揭示了维持互补机制以获得在持续宿主免疫压力下生存和持久存在的进化优势。
