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【包邮】染料法支原体污染实时定量PCR试剂盒

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商品参数

染料法支原体污染实时定量PCR试剂盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination


货号规格
Myco-qs-2020次反应
Myco-qs-5050次反应
Myco-qs-100100次反应


储存:-20度,避光保存,有效期一年。避免反复冻融。

 

试剂盒特点:

1, 本试剂盒对柔膜菌纲(包括支原体、螺原体和无胆甾原体)有极强的特异性,与柔膜菌纲以外的其他基因组无交叉反应。

2, 本试剂盒灵敏度高,最低可检出反应液中2-4个基因组。

3, 本试剂盒使用热启动的Taq酶,可抑制非特异性扩增,降低背景荧光。

4, 本试剂盒带有阳性对照样品(组分C),可用于检验试剂盒有效性,也可用于验证待测样品中是否含有PCR抑制剂。

5, 本试剂盒带有ROX参比染料,帮助校正加样误差和管间差异。

 


商品说明

支原体(Mycoplasma)属于柔膜菌(Mollicutes)纲,直径约0.1-0.3 μm,具有变形能力,因此可以轻易穿过常规的0.22 μm无菌滤膜,是常见的动物细胞培养污染源。由于支原体体积太小,在光学显微镜下不可分辨,因此细胞常常在不知不觉中被污染。

目前的经典检测方法是欧洲药典(European Pharmacopeia)2.6.7规定的体外培养法,用特殊培养基对支原体进行培养,以此检测污染情况。培养法的优点是检测灵敏度高,缺点是耗时较长,最长的需要28天之久,而且受操作人员的技能水平影响较大,不同实验室的检测误差较大。随着生物制药业的发展,很多生物制品保质期较短,因此需要一种快速、灵敏并且特异性强的支原体检测方法。欧洲药典因此接纳了核酸检测方法作为培养法的替代方案。定量PCR法可以在几个小时内完成检测,灵敏度与培养法相当,甚至更好。

本试剂盒以16S rRNA基因为靶点,设计了多对引物,可检出大部分已知的支原体,以及部分螺原体和无胆甾原体,与亲缘关系较近的革兰氏阳性菌,如链球菌、梭菌、乳杆菌等,没有交叉反应,在检测范围和特异性方面达到欧洲药典的要求。欧洲药典提及的所有支原体均在本试剂盒的检测范围内。灵敏度方面,最低检测值可以达到每个反应2-4个基因组,在不考虑DNA提取损耗的情况下,达到欧洲药典要求的10 CFU/mL的最低检测值。

本试剂盒包含热启动Taq酶、dNTP(以UTP代替了TTP)、引物、阳性对照品、SYBR Green I染料、ROX染料,和用以防止残余DNA污染的UDG(尿嘧啶-N-糖苷酶),用户只需准备好DNA样品即可使用。


注意事项:

1,     本产品仅限于科研使用,不作诊断用途。

2,     操作过程中应注意防范样品之间的串联污染。最好对工作区域进行划分,将不同步骤,如DNA提取和PCR反应液的配制,分开在不同阶段不同区域进行。使用无污染的一次性枪头,最好是带滤芯的枪头。最好在通风区域操作,操作时须佩戴无粉尘手套。

3,     对于在584 nm附近可产生激发光的仪器(大部分使用钨灯或卤素灯作为光源的仪器,还有一些仪器专门配置了LED灯,可激发~584 nm光源),ROX的反应浓度为30-50 nM。对于不能在584 nm附近可产生激发光的仪器(大部分以激光为光源的仪器),ROX的反应浓度为300-500 nM。具体可参考仪器的使用手册,下表仅供参考。


TypeqPCR system
50×ROX Reference Dye(300-500 nM)

Applied   Biosystems 7000/7700/7900HT/7300/7900HT Fast;

ABI Step One;ABI Step One Plus

500×ROX Reference Dye(30-50 nM)

Applied   Biosystems 7500/7500 Fast;Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000;

MJ Research Chromo4;Opticon (II);Corbett Rotor Gene 3000

no ROX   Reference Dye

Thermal   Cycler Dice,Bio-Rad iQ5/CFX96/CFX384/Opticon,

Roche Lightcycler,Qiagen Rotor-Gene,

Eppendorf Mastercycler,Cepheid SmartCycler

  

相关小知识:

热启动Taq酶结合了特异性单克隆抗体的DNA聚合酶,在室温下聚合酶活性被抗体抑制。在PCR循环的变性阶段,抗体受热被去除,聚合酶活性恢复,因此获得“热启动”功能,可减少残余DNA的污染,提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。

SYBR Green I可以与DNA双链的小沟结合,结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链DNA的SYBR Green I基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内DNA双链的多寡,用于实时检测PCR反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高,反应循环数越高,则双链DNA含量越高,荧光值也就越高。值得注意的是,SYBR Green I也可以结合非特异性PCR产物以及引物二聚体,此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物,可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温,使双链DNA解离为单链DNA,同时检测荧光值的变化,绘制曲线,根据荧光值观察DNA解链的温度。

UDG和dUTP可以阻止前次步骤残余DNA的扩增。dUTP可以确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基,从而阻止含有尿嘧啶的DNA作为下几轮PCR的模板。在PCR循环开始前的UDG孵育步骤,可以破坏带有尿嘧啶的PCR产物。经过该去除污染步骤后,UDG在正常的PCR循环过程中被高温灭活,对PCR反应没有影响。

ROX不参与PCR反应,在PCR反应过程中荧光没有变化,可以提供一条基线用于校正加样误差和管间差异,便于仪器自动分析报告荧光与内参ROX荧光的比值,使定量更准确。ROX染料的激发波长为584nm,发射波长为612nm。用ROX进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。


相关产品:

支原体清除剂,货号:Myco-E-h,Myco-E-1,Myco-E-5,产品链接:http://www.biothrive.cn/products/18241498.html

支原体污染PCR检测试剂盒,货号:Myco-P-20,Myco-P-50,Myco-P-100,产品链接:http://www.biothrive.cn/products/18241568.html

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