Nature发布新的AAV CRISPR筛选方法，促进致病基因的研究

苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）领导的研究团队利用腺相关病毒（AAV）开发出一种用于体内CRISPR筛选的新平台，有助于更好地了解致病基因及其在各种细胞中的表型。

研究人员于2023年9月20日在《Nature》杂志上发表了这一新成果。他们将这种名为AAV-Perturb-seq的技术应用在小鼠模型中，以了解DiGeorge综合征相关基因的表型。

DiGeorge综合征又被称为22q11.2微缺失综合征，由22号染色体上一个小片段的缺失引起。发病率大约为1/4000，通常会导致心脏问题、免疫缺陷和认知问题等症状。

研究人员指出，目前的CRISPR筛选方法主要使用慢病毒，仅限于体外应用，而且只适用于这种病毒可以感染的组织。他们认为，迫切需要适用于不同组织的体内单细胞筛选，这也是他们选择AAV的原因，因为AAV可以静脉注射，靶向更大范围的组织和细胞类型。

“AAV-Perturb-seq让人们有机会直接分析同一动物体内多个细胞类型中的多个基因，而不受组织或发育时间点的限制，为研究体内的健康和病变过程提供了更多可能，”作者写道。

研究人员首先创建了一个AAV向导RNA（gRNA）文库，其重点是位于人类22q11.2基因座内并在小鼠基因组中高度保守的基因。他们鉴定出29个在成年小鼠皮层中表达的基因，并为其设计了gRNA序列。

接下来，他们将含有gRNA的重组AAV注射到LSL-Cas9小鼠中，并在三周后采集大脑样本。他们从各个细胞分离出细胞核后开展聚类分析，结果显示AAV感染了小鼠的神经元和非神经元脑细胞。

他们的分析结果表明，对于22q11.2缺失小鼠模型，DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L基因的扰动解释了大约40%的转录变化。然而，这些基因无法解释DiGeorge综合征患者为何容易患上神经发育和精神疾病。

尽管人们对每个基因在成熟脑细胞中的功能知之甚少，也从未开展过系统研究，但研究人员发现，DGCR14和GNB1L与成人神经元病理学之间存在关联。

“总的来说，我们的结果表明，DGCR8、DGCR14和GNB1L可能对22q11.2微缺失综合征有影响，它们通过调控成熟神经元的RNA广泛改变体内与疾病易感性相关基因的表达，”作者总结道。

作者表示，下一步他们将确定在发育期间或之后恢复DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表达是否能挽救与22q11.2微缺失综合征相关的神经元和认知表型。

原文：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06570-y