外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌释放的直径20-250纳米的非复制性球形颗粒，由外膜出芽形成。其成分包括脂多糖（LPS）、甘油磷脂、外膜蛋白、周质蛋白和肽聚糖，甚至含有难以解释的核酸成分。OMVs在生物膜形成、种间通讯、毒素传递以及酶和基因交换中发挥重要作用。近年来，OMVs因其携带多种微生物相关分子模式（MAMPs）和强大的免疫刺激特性，成为疫苗和抗肿瘤免疫治疗产品的热门平台。通过基因工程、化学偶联或吸附手段，OMVs可携带异源抗原，激发强烈的体液和细胞免疫反应。然而，OMVs内源性蛋白如何影响异源抗原的免疫应答效果尚不明确，尤其是T细胞反应的定量关系亟待探索。本研究利用大肠杆菌Δ60株（E. coli Δ60）来源的OMVs（OMVsΔ60），聚焦细胞免疫应答，旨在阐明MHC I和MHC II表位浓度与抗原特异性T细胞频率之间的关联。
生物信息学分析预测OMVs富含大量MHC II表位，免疫后可能诱导高度多克隆的CD4+ T细胞群体，但单个表位特异性T细胞克隆频率较低。为确定诱导可检测水平的表位特异性T细胞所需的最低表位浓度，研究选取了四种在BALB/c小鼠中具有免疫原性的MHC II表位（M03、M20、M27和M68）。通过将合成肽段（50 μg）与10 μg OMVsΔ60混合后腹腔注射免疫小鼠，两次免疫后通过ELISpot检测脾细胞中干扰素-γ阳性（IFN-γ+）T细胞频率。结果显示，所有表位均能诱导产生50-200个IFN-γ+ T细胞/5×105脾细胞。进一步选用免疫原性较强的M27和M68表位进行三剂免疫方案，发现在脾脏、血液和淋巴结中均能检测到表位特异性T细胞，且皮下免疫与腹腔免疫效果相当。通过调整肽段剂量（0.1-50 μg）与固定剂量OMVsΔ60（10 μg）的组合，发现当肽段量≥1 μg（即≥10%总OMV蛋白）时方可检测到表位特异性IFN-γ+ T细胞，10 μg时达到平台期。降低OMVs用量至1 μg仍可诱导良好的T细胞反应。这些结果表明，只有表位浓度超过总OMV蛋白的10%才能产生可测量的CD4+ T细胞应答。为验证这一结论，研究将M27和M68表位融合至FhuD2蛋白C端，并在OMVs中表达（表位占比约2.5%）。免疫后未能检测到显著的IFN-γ+ CD4+ T细胞，进一步证实低浓度表位难以突破内源性表位的竞争。研究选用MHC I限制性表位OVA257–264和SV40 IV404–411 C411L，通过将不同剂量肽段（0.5、5、50 μg）与10 μg OMVsΔ60混合后免疫C57BL/6小鼠，通过流式细胞术和ELISpot评估CD8+ T细胞频率。结果显示，即使肽段剂量低至0.5 μg（约0.5%总OMV蛋白），也能诱导高频率的表位特异性CD8+ T细胞，且增加肽段浓度并未显著提升T细胞频率。这表明MHC I表位激活CD8+ T细胞的效率远高于MHC II表位激活CD4+ T细胞。
通过基因工程将多拷贝OVA表位或单拷贝SV40表位融合至FhuD2蛋白，并表达于OMVs中（OVA表位占比约0.4%，SV40表位占比约0.03%）。免疫实验表明，工程化OMVs可诱导与肽段-OMVs混合免疫相近水平的CD8+ T细胞频率，证实即使极低浓度的MHC I表位也能有效激活细胞免疫。OMVs作为一种新兴疫苗平台，其诱导细胞免疫的机制尚不完全清楚。本研究通过定量分析，揭示了MHC II表位需高浓度（>10%总OMV蛋白）才能激活CD4+ T细胞，而MHC I表位在低浓度（<1%）下即可激发强效CD8+ T细胞反应。这种差异可能与CD8+ T细胞激活依赖多克隆CD4+ T细胞辅助有关：抗原呈递细胞（APCs）同时呈递MHC I表位和OMVs内源性MHC II表位，使得CD8+ T细胞能够获得多种CD4+ T细胞的帮助，从而放大免疫应答。研究结果对疫苗设计具有重要指导意义：针对需要高频率CD4+ T细胞的疫苗，需通过外源添加表位提升浓度；而CD8+ T细胞导向的疫苗则可通过基因工程实现低剂量表位的高效激活。此外，OMVs内源性蛋白的免疫干扰效应也得到进一步明确——尽管它们可能稀释特定免疫应答，但其提供的交叉T细胞帮助有助于增强整体免疫效果。未来研究需关注OMVs在不同细菌来源中的普适性、抗原呈递的具体路径（如MHC I表位是否需定位於OMVs表面）、以及Th17等其它T细胞亚群的作用。通过单细胞T细胞受体（TCR）测序解析OMVs诱导的T细胞多克隆性，将深化对免疫机制的理解。动物实验使用6-8周龄雌性BALB/c和C57BL/6小鼠，通过腹腔或皮下注射OMVsΔ60与肽段混合物进行免疫。脾细胞、外周血单核细胞（PBMCs）和淋巴结细胞在末次免疫后5天采集，通过ELISpot和流式细胞术检测IFN-γ+ T细胞频率。OMVs由大肠杆菌BL21(DE3)Δ60株培养纯化，工程化OMVs通过将表位基因融合至FhuD2蛋白并表达于OMVs中制备。肽段由公司合成，免疫细胞实验采用标准流程进行刺激与检测。
