微生物相互作用对生态学、健康和疾病至关重要，但研究这些复杂关系的高通量工具仍然稀缺。研究人员介绍了Polychip，一种完全集成的高通量液滴微流控平台，彻底改变了微生物相互作用筛选。通过将六种微流控操作无缝集成到单个芯片上，Polychip实现了99.7%的效率，并比传统高通量液体处理机器人方法加速筛选11–14倍，且人工干预最少。使用Polychip，研究人员针对多药耐药（MDR）病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）筛选了2.24×106个土壤提取微生物。该过程回收了1.96×104个具有抗菌活性的“命中”液滴，确认准确率为48%。通过此筛选，鉴定出三种表现出高效力和广谱抗菌活性的环境分离株（寡养单胞菌属，Stenotrophomonas sp.）。这些三种环境分离株的上清液抑制了革兰氏阴性MDR病原体鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生长。通过全基因组测序、代谢途径分析和质谱分析，研究人员将分泌的化合物鉴定为肠杆菌素（enterochelin）。这证明了Polychip在快速发现抗菌活性方面具有前所未有的单细胞分辨率和高通量筛选能力，开辟了对抗耐药微生物病原体的新前沿，并更广泛地推进微生物生态学研究。
**论文解读：Polychip平台——高通量液滴微流控革新微生物相互作用研究**
**1. 研究背景、问题与意义**
微生物群落通过复杂的相互作用驱动全球元素生物地球化学循环，并影响宿主（包括动植物）健康。宏基因组学和蛋白质组学进展揭示了环境微生物及其产生和交换的分子多样性，以及复杂的微生物相互作用。高通量分析微生物相互作用具有广泛用途，从更好地理解微生物群落功能、稳定性和进化，到革新从环境微生物群落中发现天然产物。然而，目前缺乏可扩展且高分辨率的实验平台来执行这些进展所需的多步骤微生物相互作用分析。传统的检测和筛选方法（如基于平板和流式细胞术）存在分辨率低、通量不足或高劳动力需求等局限；机器人液体处理平台虽可用于多步骤分析，但成本高昂且编程复杂，通量仍有限。现有单细胞分辨率微流控平台（如iChip）缺乏高效的大规模筛选能力。液滴微流控技术虽能封装细胞于皮升级液滴中，但现有系统在处理复杂工作流程（如多步骤操作集成、自适应培养和连续筛选）方面存在局限，且缺乏从环境样本到目标表型分离的完整端到端工作流程展示。为克服这些瓶颈，研究人员开发了Polychip平台，通过集成所有关键液滴操作步骤，实现了高通量、单细胞分辨率、高效率和全自动的微生物相互作用筛选。该研究以《Advanced Science》发表，展示了其在抗菌活性发现中的突破性应用，为对抗耐药微生物病原体及推进微生物生态学研究开辟了新途径。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员构建了Polychip平台，该平台集成了六种关键微流控操作于单芯片：单细胞液滴封装发生器、基于先进先出（FIFO）原理的垂直液滴培养室、高保真液滴同步与融合模块、带微阀控制的多路液滴培养室、介电泳线性液滴分选器以及液滴分配模块。平台通过现场可编程门阵列（FPGA）控制的图形用户界面（GUI）实现自动化操作。样本来源为美国俄克拉荷马州高草草原生态系统的土壤，采用直接细胞提取法获得环境微生物群落。研究中使用了绿色荧光蛋白（GFP）标记的多药耐药（MDR）病原体铜绿假单胞菌作为靶标，并通过全基因组测序、AntiSMASH分析、液相色谱-质谱联用（LC-MS）及铬天青S（CAS）琼脂检测等方法鉴定抗菌化合物。
**3. 研究结果**
**2.1 Polychip操作原理**
研究人员设计了Polychip的结构和工作流程，以复制传统液体处理机器人筛选的关键阶段：单细胞分离、克隆扩增培养、与靶病原体共培养、分选和回收具有抗菌活性的分离株。平台利用液滴在载油中的自然浮力，从底层到顶层依次处理液滴操作：底层生成封装环境微生物的单细胞液滴（直径50 μm，65.5 pL），并流入垂直培养室（容量约400万液滴）培养48小时；利用FIFO机制确保所有液滴培养时间一致。培养后，液滴被输送至融合区，与封装GFP表达靶病原体的液滴（直径85 μm，321.5 pL）融合，然后进入多路液滴培养室（通过8个微阀控制）再培养48小时。共培养后，基于GFP荧光强度分选液滴：低荧光（抗菌活性）的液滴被收集为“命中”液滴，并分配至琼脂平板。液滴生成、融合和分选效率分别达到100%、100%和99.78%，总体效率为99.7%，筛选时间较传统方法缩短11–14倍。
**2.2 Polychip鉴定抗菌活性**
研究人员利用Polychip筛选土壤微生物库针对MDR铜绿假单胞菌的抗菌活性。共封装2.24×106个液滴，经共培养和分选后，获得1.96×104个低GFP强度的“命中”液滴（占输入库的0.89%）。这些液滴被分配至琼脂平板，挑取164个形态多样的菌落进行Kirby-Bauer测试验证，其中79个菌落（48%）表现出强抗菌活性（抑菌圈直径>8 mm），被选为“高优先级”候选株。通过全长16S测序分析，79株菌分属四个门，其中60株属于假单胞菌门（Pseudomonadota）。表现最强的三株（P1、P10、P27）均为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.），其活细胞和上清液均能显著抑制MDR铜绿假单胞菌的生长（P1效果最佳，活细胞共培养抑制约70%，上清液抑制约50%）。
**2.3 广谱抗菌活性**
研究人员测试了P1、P10和P27对革兰氏阴性MDR鲍曼不动杆菌和革兰氏阳性MRSA的抗菌活性。结果显示，三株菌的上清液对MDR鲍曼不动杆菌的抑制率分别为16%、28%和29%；活细胞共培养对MRSA的抑制率分别为65%、64%和49%，上清液抑制率分别为40%、37%和36%。这表明这些菌株产生的抗菌化合物具有广谱活性。
**2.4 抗菌分子鉴定**
通过全基因组测序、AntiSMASH分析和次级代谢途径分析，研究人员发现P1、P10和P27的基因组中含有三个次级代谢基因簇，分别编码芳基多烯（APE）、溶菌素（RiPP-like）和2,3-二羟基苯甲酰丝氨酸（NRP-metallophore, NRPS）。其中NRPS簇与已知簇（肠杆菌素，enterochelin）相似度最高（89%）。基于KEGG数据库的途径分析，鉴定出肠杆菌素、杆菌素、myxochelin前体和vibriobactin为潜在铁载体候选物。
**2.5 抗菌化合物确认**
研究人员通过CAS琼脂检测确认三株菌在铁限制条件下产生铁载体。Kirby-Bauer测试显示，随着FeCl3浓度增加，抗菌活性降低，提示铁载体参与抗菌作用。LC-MS分析确认P1、P10和P27上清液中存在与肠杆菌素标准品保留时间和质谱峰一致的化合物。进一步Kirby-Bauer测试显示肠杆菌素标准品对MDR铜绿假单胞菌呈剂量依赖性抑菌效果。综上，证实肠杆菌素是这些菌株产生的抗菌化合物。
**4. 讨论与结论**
**讨论总结：** 传统环境微生物天然产物筛选受限于低通量、低重现性和高错误率。Polychip平台通过将单细胞封装、培养、融合、共培养、分选和分配集成于单芯片，克服了这些障碍。以筛选土壤微生物对抗MDR铜绿假单胞菌为例，6天内从2.18×106个液滴中识别出1.96×104个“命中”液滴，挑取164个菌落中约48%具有强抗菌活性，筛选速度比传统机器人方法快11–14倍。额外针对MDR鲍曼不动杆菌的筛选也验证了其可重复性（3.14×106个微生物，78个菌落中24个确认具有强活性）。Polychip的集成设计和自动化操作（基于FPGA的GUI）显著提高了效率和可靠性。与现有方法对比，Polychip在单次运行容量、操作精度、单细胞评估、所需体积、集成步骤数量和处理时间等方面均具有优势。通过抑制病原体生长（P1活细胞抑制约70%，上清液抑制约50%），估算三个月内可产生多达30万个抗菌“命中”。进一步分析确认抗菌机制为肠杆菌素，一种通过铁螯合发挥作用的儿茶酚型铁载体，其与抗生素偶联后可增强对革兰氏阴性菌的疗效。该平台不仅可用于GFP标记病原体，还可扩展至厌氧条件筛选。未来可探索多物种协同、诱导或交叉喂养等高级微生物相互作用。Polychip为微生物组研究、合成生物学筛选、肠道微生物分析、生物标志物筛选及新型化合物发现等应用提供了强有力的工具。
**研究结论翻译：** 通过解决传统基于液滴的筛选方法的关键瓶颈，Polychip平台为下一代高通量筛选铺平了道路，可无缝集成到各种应用中。尽管本概念验证研究使用了GFP表达靶病原体，Polychip也兼容筛选其他荧光表达的高优先级病原体，以及针对非工程化靶病原体进行筛选。例如，荧光标记靶病原体是筛选临床或环境相关目标生物体的选择。此外，Polychip还支持在厌氧条件下进行筛选，只需将系统置于厌氧箱内，因为芯片由透气性聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。由于平台通过连接的笔记本电脑上的GUI管理，用户可以从箱外操作系统并进行筛选。这种灵活性确保了系统在不同微生物发现活动中的广泛适用性。在本研究中，研究人员仅专注于从单个环境分离株中鉴定针对靶病原体的抗菌活性。然而，未来工作可以利用Polychip探索更高级的微生物相互作用，如多物种协同、诱导或交叉喂养，以研究新型抗菌机制。除抗菌发现外，该平台还可应用于微生物组研究、合成生物学筛选、肠道微生物组分析、生物标志物筛选以及新型化合物、微生物和酶活性的生物技术发现。其高效率和自动化单细胞分辨率筛选能力允许以增强的通量精确研究复杂微生物相互作用，支持发现活动并推进药物发现和联合体筛选。
