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关于TDCPP在GT1-7细胞中诱导DNA损伤的机制学研究摘要作为一种典型的有机磷酸酯化合物，三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯（TDCPP）同时具有雌激素活性和遗传毒性。然而，雌激素信号通路在TDCPP诱导的遗传毒性中的作用尚不清楚。本研究评估了TDCPP（0.001-200μM）对GT1-7小鼠下丘脑细胞中DNA损伤和修复相关指标的影响，并探讨了雌激素核受体（ERα/β）和G蛋白偶联的雌激素膜受体1（GPER1）及其下游的ERK1/2和AKT信号通路在TDCPP诱导的DNA损伤中的作用。结果表明，TDCPP暴露增加了细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的水平，导致DNA损伤和G2/M细胞周期停滞，并加剧了线粒体损伤和微核的形成。此外，TDCPP显著增加了ATM和γ-H2AX的蛋白质表达，这两种蛋白是DNA双链断裂（DSB）的关键标志物，并上调了大多数DSB修复相关基因的mRNA表达，同时下调了大多数DNA单链断裂（SSB）修复相关基因的mRNA表达。TDCPP还上调了GPER1的蛋白质和基因表达，并增强了ERK1/2的磷酸化。用GPER1抑制剂G15或ERK1/2抑制剂U0126预处理显著抑制了TDCPP诱导的ATM和γ-H2AX蛋白质表达的上调，逆转了DSB/SSB修复相关基因的mRNA水平变化，并减少了GT1-7细胞中的DNA损伤。这些发现表明，TDCPP激活了GPER1-ERK1/2信号通路，该通路在其DNA损伤效应中起着关键作用。 结论TDCPP通过激活GPER1-ERK1/2信号通路在GT1-7细胞中诱导DNA损伤。 引言有机磷酸酯（OPEs）是一类新兴的有机磷酸酯阻燃剂（OPFRs）（Ospina等人，2018年）。三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯（TDCPP）是一种高产量的OPE，因其强大的阻燃性能而被广泛用于室内家具和家用电器中（Wang等人，2020a年）。由于TDCPP是通过物理混合而非化学键合到产品中的，因此它容易通过挥发、磨损或渗漏进入环境中（Wang等人，2020a年）。环境调查显示，TDCPP在全球范围内普遍存在，其浓度在旧金山湾达到450 ng/L（Sutton等人，2019年），德国易北河为155±14 ng/L（Wolschke等人，2015年），中国青岛附近的海水为109.3 ng/L（Hu等人，2014年）。室内环境中的浓度通常更高，例如中国室内灰尘中的浓度为220.0 ng/g，而室外仅为68.2 ng/g（Wang等人，2020b年）。人类接触TDCPP的证据包括在北极灰鸥体内的检测（Hallanger等人，2015年）、超过90%的人类尿液中的存在（通过其代谢物BDCPP，范围：ND-169 ng/mL）（Ospina等人，2018年），以及中国河北省36.7%的血浆样本中的存在（范围：ND-0.51 ng/mL）（Wang等人，2020a年）。特别值得关注的是，TDCPP能够穿过胎盘（在中国胎盘样本中的检测率为44%，最高可达515 ng/g lw）（Ding等人，2016年）并通过母乳（日本样本中为162 ng/g lw）传递给婴儿，这提示可能存在跨代健康风险。 DNA（遗传物质）容易受到化学损伤，这种损伤会激活DNA损伤反应（DDR）——一个协调DNA修复的保护网络（Yedidia-Aryeh，Goldberg，2022年）。关键DDR成分如ATM（共济失调-毛细血管扩张突变型）和γ-H2AX（DNA双链断裂的标志物）在损伤时被激活，从而促进修复（Shibata，Jeggo，2021年）。因此，监测这些DDR相关基因和蛋白质的激活情况也可以作为检测DNA损伤发生的可靠指标。 研究表明，TDCPP可以通过ERα或新型膜雌激素受体（GPER1）通路发挥雌激素活性（Zhang等人，2014年；Ji等人，2022年）。像双酚A（BPA）和17β-雌二醇（E2）这样的雌激素化合物通过激活ERα通路增加了MCF-7细胞中早期DNA断裂标志物γ-H2AX的含量（Iso等人，2006年）。然而，雌激素受体，特别是GPER1介导的信号通路，在TDCPP诱导的DNA损伤中的作用仍不清楚。 越来越多的证据表明，神经系统是OPFRs毒性的敏感靶标（Li等人，2025年），但驱动这种神经毒性的关键机制尚未明确。鉴于此，表达ERα和GPER1的GT1-7小鼠下丘脑细胞系是研究雌激素介导效应的理想模型（Lei等人，2022年）。在本研究中，使用GT1-7细胞通过检测一系列与DNA损伤相关的生物指标和分子靶标来评估TDCPP对DNA损伤的影响。我们进一步研究了ERα/β、GPER1及其下游的ERK1/2和PI3K-AKT信号通路在调节DNA损伤中的作用，以阐明潜在的信号转导机制。这些发现为了解OPEs的遗传毒性机制提供了新的见解。 试剂三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯（TDCPP）（CAS：13674-87-8；纯度>98%）购自Macklin（中国上海），其溶液在二甲基亚砜（DMSO，99.5%，AMRESCO，PA）中配制。3-(4,5)-二甲基噻唑(-2-y1)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。关于抗体和抑制剂的信息可以在我们之前的研究中找到（Lei等人，2017年，Lei等人， TDCPP对GT1-7细胞活力和细胞内ROS水平的影响低浓度的TDCPP在所有测试时间点对细胞活力均无显著影响，而超过25 μM的浓度在三种暴露持续时间下均显著抑制了细胞活力（图1A）。值得注意的是，在50 μM及更高浓度下，细胞活力在暴露48小时和72小时后降至对照水平的50%以下。 在0.1-10 μM的TDCPP暴露组中，细胞内荧光强度呈剂量依赖性增加（图1B）。定量分析证实了这一点 讨论DNA损伤是遗传毒性的标志，包括多种形式，如DNA单链断裂（SSB）/双链断裂（DSB）和DNA模板改变（Rahimian等人，2020年）。近年来，多种EDCs，如杀虫剂、除草剂和BPA，在体内/体外研究中均被报道具有遗传毒性效应（Ansari等人，2017年；Mahemuti等人，2018年；Prathiksha等人，2023年）。Saquib等人（2021年，2022年）相继发现，暴露于三(2-氯异丙基)磷酸酯（TCPP）和 结论本研究系统地研究了TDCPP对GT1-7细胞的遗传毒性效应，并探讨了其潜在机制。结果表明，TDCPP暴露浓度依赖性地增加了细胞内ROS和MDA的水平，导致DNA损伤，引发了G2/M期细胞周期停滞，并加剧了线粒体损伤和微核的形成。由于DNA损伤是遗传毒性的最常见表现之一，这些发现证实了TDCPP的遗传毒性潜力。 |
