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TANK结合激酶1调控布鲁氏菌的细胞内存活摘要布鲁氏菌是布鲁氏菌病的致病菌，是一种全球范围内重要的细胞内病原体。TANK结合激酶1（TBK1）是I型干扰素诱导途径的关键组成部分，已知在控制细胞内细菌感染中起着关键作用。然而，TBK1在布鲁氏菌感染过程中的功能仍知之甚少。在本研究中，我们探讨了TBK1在布鲁氏菌感染中的作用。我们观察到布鲁氏菌感染会上调巨噬细胞中的TBK1表达。通过使用针对TBK1的小干扰RNA（siRNAs）和过表达方法，我们研究了TBK1如何调节布鲁氏菌的细胞内存活。结果表明，TBK1的敲低显著促进了细胞内细菌的生长，并减少了促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的产生。相反，TBK1的过表达抑制了细胞内布鲁氏菌的生长，并增强了这些细胞因子的分泌。此外，布鲁氏菌感染还刺激了小鼠中的TBK1表达，而TBK1的敲除促进了细菌在体内的存活。进一步的研究表明，在布鲁氏菌感染期间，TBK1的抑制显著降低了NF-κB的活性，而TBK1的过表达则增强了其活性。总体而言，我们的发现表明TBK1在体外和体内都是布鲁氏菌存活和生长的关键调节因子。TBK1诱导促炎细胞因子和激活NF-κB的机制需要进一步研究，以阐明其在细菌细胞内持续存在中的作用。 引言布鲁氏菌病是一种由细胞内病原体布鲁氏菌引起的传染病，是一种全球范围内普遍存在的动物源性疾病，以其高传染性和对公共卫生及经济稳定的重大影响而著称（Cloeckaert等人，2024年）。人类感染主要通过直接接触受感染的动物或摄入未经煮熟的动物源性产品（如未经巴氏杀菌的乳制品和肉类）而发生。典型的临床表现包括发热，并可能发展为严重的并发症，如关节炎、脾肿大、胸膜炎、脊柱炎和心内膜炎（Alikhani等人，2022年；Basaran等人，2025年；Chen等人，2025年；Spernovasilis等人，2024年）。在动物中，布鲁氏菌感染常常导致流产和不孕，造成重大经济损失，并对公共卫生和畜牧业构成持续威胁（Moreno，2014年）。 布鲁氏菌缺乏经典的毒力因子；相反，其致病性主要源于其破坏宿主免疫防御的能力以及在宿主细胞（如巨噬细胞、树突状细胞和胎盘滋养层细胞）中长期存活和复制的能力（Martirosyan和Gorvel，2013年；von Bargen等人，2012年）。因此，深入理解这些致病机制对于制定有效的布鲁氏菌病预防和控制策略至关重要。 TANK结合激酶1（TBK1）在先天免疫信号传导中起着核心作用，它整合了由Toll样受体、NOD样受体和RIG-I样受体引发的信号。TBK1作为一个关键的适配器，将多种模式识别受体与下游反应连接起来，在诱导I型干扰素的产生、连接cGAS-STING通路以及激活NF-κB方面发挥着重要作用（Ikeda等人，2007年；Larabi等人，2013年）。研究表明，TBK1的过表达显著增强了干扰素和促炎细胞因子的释放，从而抑制了疱疹病毒和猪圆环病毒等病原体的复制（Huang等人，2021年）。相反，许多病原体已经进化出对抗TBK1依赖性免疫的策略。例如，猪流行性腹泻病毒（PEDV）利用其膜蛋白M靶向干扰素调节因子7，从而抑制TBK1介导的IKK磷酸化，促进病毒在猪肠上皮细胞中的复制（Li等人，2021年）。同样，结核分枝杆菌（M. tuberculosis）分泌蛋白质MmsA，该蛋白质与p62和STING结合，触发STING的选择性自噬。这一过程减少了TBK1和IRF3的磷酸化，减弱了I型干扰素反应，促进了病原体在宿主细胞内的持续感染（Sun等人，2020年）。 TBK1在宿主防御各种病原体中的关键作用已得到充分证实；然而，其在布鲁氏菌梅利滕西斯亚种（B. melitensis）感染过程中的功能尚未有报道。为填补这一空白，我们研究了TBK1与B. melitensis M5-90之间的相互作用。我们的发现表明，M5-90感染在RAW 264.7巨噬细胞和小鼠模型中均上调了TBK1的表达。功能上，TBK1的敲低促进了M5-90的细胞内存活，并减少了促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的产生。相反，TBK1的过表达抑制了细菌的存活并增强了这些细胞因子的分泌。从机制上看，我们发现TBK1对于感染后的NF-κB完全激活是必需的。综上所述，这些结果表明TBK1是抵抗布鲁氏菌的关键宿主防御因子，通过调节促炎反应和NF-κB信号通路来限制感染。 实验部分伦理声明所有动物实验均获得了商丘师范学院动物实验伦理委员会的批准（授权编号：2025-2）。所有实验均按照中国科学技术部发布的《实验动物指南》进行。在整个研究过程中，我们尽一切努力减轻动物的痛苦。 试剂抗TBK1单克隆抗体购自Epitomics（美国加州伯灵厄姆）。抗-β-actin和抗-p65 布鲁氏菌在RAW 264.7细胞中诱导TBK1表达为了确定TBK1在布鲁氏菌感染中的作用，我们首先评估了M5-90菌株感染后RAW 264.7巨噬细胞中的TBK1表达情况。感染显著上调了TBK1的mRNA和蛋白质水平（图1A和1B），表明布鲁氏菌在巨噬细胞中诱导了TBK1的表达。 TBK1敲低促进了巨噬细胞中布鲁氏菌的细胞内复制为了评估TBK1在布鲁氏菌细胞内存活中的作用，我们使用特异性siRNA在RAW 264.7细胞中敲低了TBK1的表达。通过RT-qPCR确认了敲低效率 讨论TBK1是IκB激酶家族中高度保守且广泛表达的成员（Tojima等人，2000年），在宿主防御细胞内细菌方面起着关键作用。先前的研究表明，TBK1的缺乏会促进细菌的复制；例如，tbk1缺陷的RAW 264.7细胞在感染后48小时内支持大肠杆菌的生长显著增强（Panomket等人，2008年）。同样，布鲁氏菌梅利滕西斯亚种的复制也显著增加 |
