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建模呼吸道上皮HBEC3-KT细胞对生物膜塔的全局转录响应肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是一种引起慢性呼吸道感染的病原体，在无细胞培养和 submerged 组织培养模型系统中均以生物膜塔(biofilm towers)的形式生长，且在此类结构中其毒力因子产生减少。这些生物膜塔的临床相关性尚不明确，因为在肺炎支原体的空气-液体界面(Air-Liquid Interface, ALI)模型中尚未对其进行检查。研究人员利用分化的人支气管上皮细胞系HBEC3-KT在ALI条件下，理解肺炎支原体如何在比 submerged 系统更具生理相关性的环境中生长并与气道细胞相互作用，并表征宿主细胞在此背景下的全局转录响应。研究人员使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy, SEM)检查了感染后不同时间点肺炎支原体在HBEC3-KT细胞上的生长情况，并采用了改良方案以保存黏液层。该方案揭示了大量与纤毛尖端及黏液层相关的生物膜塔。对感染后第1天(Day 1)和第7天(Day 7) HBEC3-KT细胞的RNA测序(RNA-seq)分析表明，早期存在温和的细胞因子反应，随后诱导了III型干扰素(Type III Interferon)，这一结果不仅出乎意料——因为该反应通常见于病毒感染，而且因为已知肺炎支原体在ALI条件下并不进入宿主细胞。研究人员利用跨上皮电阻(Transepithelial Electrical Resistance, TEER)和宿主细胞基底侧培养基的培养来评估屏障功能，结果显示仅在长时间感染后才发生破坏。这些结果共同表明，肺炎支原体在形成生物膜塔生长时，仅引发选择性的炎症反应，从而限制了对宿主细胞的损伤，促进了慢性感染。 研究人员针对肺炎支原体在空气-液体界面(ALI)环境下形成生物膜塔及其对人支气管上皮细胞的分子机制进行了系统性探究，旨在阐明其在慢性呼吸道感染中的致病机理。该研究构建了分化的HBEC3-KT细胞ALI感染模型，结合扫描电子显微镜(SEM)、转录组测序(RNA-seq)及屏障功能检测，深入解析了宿主与病原体的互作动态。此项研究成果已发表于《Infection and Immunity》。 关键技术方法包括：构建HBEC3-KT细胞ALI分化模型以模拟生理气道环境；采用标准固定与赖氨酸乙酸-钌红(Lysine Ruthenium Red, LRR)固定两种方案处理样本，利用扫描电子显微镜观察生物膜形态；对感染后不同时间点（D1、D7）的宿主细胞进行RNA提取、测序及生物信息学分析（包括差异表达基因识别、Reactome、KEGG、GO通路富集分析及基因集富集分析GSEA）；通过测量跨上皮电阻(TEER)及平板计数法(CFU)检测基底室细菌穿透情况，评估上皮屏障完整性。 研究结果如下： Distinct biofilm towers at ALI compared to submerged culture 研究人员通过在Transwell小室膜上分别进行 submerged 培养和ALI培养，发现ALI条件下生长的肺炎支原体生物膜塔外观显著不同，表面粗糙且结节状，缺乏 submerged 培养中常见的单个附着细胞，表明物理环境显著影响生物膜形态。 M. pneumoniae biofilm tower development on HBEC3-KT cells at ALI SEM观察显示，感染后第7天(D7)开始形成小型塔状结构，至D10结构明显增大但仍少于预期。生物膜塔常导致上皮表面出现凹陷或孔洞。采用标准固定方案时观察到的结构稀少，提示黏液层可能在样本制备中被破坏。 Preservation of biofilm towers in mucus by LRR fixation 应用LRR固定方案后，研究人员在感染细胞表面观察到高密度的生物膜塔，直径约2 μm，常位于纤毛尖端，证实先前观察结果的偏差源于黏液层流失，且生物膜塔确实存在于黏液环境中。 Global transcriptional changes in HBEC3-KT cells in response to M. pneumoniae infection RNA-seq分析鉴定出D1有340个差异表达基因(DEGs)，D7有411个DEGs。聚类热图显示D1与D7的基因表达模式存在显著差异，反映了宿主反应的时序性变化。 Stress responses, cell cycle suppression, and limited inflammatory signaling in early infection D1的通路分析显示细胞周期和增殖程序被显著抑制，同时激活了氧化应激和外源性物质解毒反应（如CYP1A1）。尽管部分促炎信号上调，但经典炎症因子(IL-1α, IL-6)仅微弱诱导，且存在IL1R2等诱饵受体的上调，表明早期存在抗炎调节，旨在维持屏障稳态。 Interferon signaling and broad inflammatory pathway activation late in infection 至D7，转录谱发生显著转变，表现为干扰素刺激基因(ISGs)、干扰素-α/γ反应、TNF-α及IL-6/JAK/STAT3通路被广泛激活。个体基因分析显示中性粒细胞趋化因子(CXCL8, CSF3)和IL-17C显著诱导，同时上皮结构及稳态相关基因（如胶原蛋白、紧密连接蛋白）表达下调，预示屏障功能受损。 Changes in airway epithelial transcriptional response over the course of M. pneumoniae infection 比较D7与D1的转录组发现，干扰素信号通路随时间显著增强，而上皮结构、粘附及代谢通路被抑制。TLR2和TLR7的表达在D7显著高于早期，与先天免疫感知的增强一致。黏蛋白基因(MUC)呈现动态变化，MUC5AC早期上调后期下降，MUC2和MUC13则持续表达。 Epithelial barrier function during the course of infection 功能实验证实，尽管早期基因表达提示屏障保护，但后期屏障逐渐受损。基底室培养基中直至D10才检测到可定量的肺炎支原体菌落形成单位(CFU/mL)，且随感染时间延长而增加。TEER值在D7后开始显著下降，至D15达到统计学显著性，证实了上皮完整性的渐进性丧失。 讨论部分总结指出，本研究首次在ALI条件下证实了肺炎支原体生物膜塔的形成，并揭示了其独特的形态学特征依赖于黏液层的保存。转录组学数据构建了宿主响应的时间轴：早期表现为应激适应与有限的炎症反应，利于病原体长期定植；晚期则演变为干扰素主导的强烈炎症及上皮屏障退化。这种由生物膜介导的“低损伤”策略——即通过降低毒力因子产生并诱导选择性免疫应答——可能是肺炎支原体实现慢性感染的关键机制。此外，研究还讨论了临床样本中黏膜相关生物膜难以检测的方法学原因。该研究为理解肺炎支原体慢性感染的发病机制提供了新的视角，并为针对上皮修复或干扰素信号调控的治疗策略提供了理论依据。 |
