细胞和病毒活疫苗中支原体污染的荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：

【背景】在生物学研究和生物制品生产中常受支原体污染困扰，传统检测方法如经典培养法耗时长、灵敏度低，而普通PCR法易受抑制剂干扰且无法定量，难以满足疫苗生产质控及科研试验中对快速精准检测的需求，【目的】通过建立一种覆盖范围广、特异性强、灵敏度高的通用型荧光定量PCR检测方法，为细胞培养物、病毒活疫苗及生物原料中支原体污染提供高效筛查工具。【方法】首先从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的16S/18S rRNA参考序列的库文件SILVA_138.1_SSURef，经去冗余处理后筛选出181种/株已分类支原体的16S rRNA全长序列。经过多序列比对确定V6—V8高变区为最佳检测靶点，通过Primer Premier 5.0设计引物及探针，最终筛选出3条引物及1条双淬灭探针，通过优化引物探针配比、反应退火温度建立支原体荧光定量PCR检测方法。方法验证包括：（1）引物探针验证：选取与细胞的支原体污染相关的11种支原体/甾原体（如鸭支原体、牛支原体、莱维德氏甾原体等）进行qPCR检测；（2）灵敏性试验：选取3种支原体（鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、猪肺炎支原体），经10倍梯度稀释后进行qPCR检测并绘制标准曲线；（3）特异性试验：选取常见4种细菌（沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、布鲁氏菌）和8种动物细胞（Marc145细胞、Vero细胞、CEF细胞等）进行qPCR检测；（4）重复性试验：取浓度为1.0×10⁸—1.0×10¹ copies/μL的鸡滑液囊支原体BHQ03株进行组内与组间重复性测试；（5）实际样本试验：对24批（种）动物病毒活疫苗（包括鸡、鸭、猪和犬用活疫苗）、20份8种细胞培养物样本以及8种毒种进行qPCR、普通PCR和经典培养法平行比对，以评价其实际应用效果。【结果】建立的qPCR支原体检测方法使用了3条引物和1条探针，采用两步法扩增程序，退火温度为56 ℃。采用本方法对引起细胞污染最常见的支原体/甾原体种类进行检测，结果均为阳性；特异性试验结果良好，对常见细菌和动物细胞检测结果均为阴性；重复性试验结果显示Ct值变异系数（CV）均小于2%，表明本方法稳定性好；灵敏度试验结果表明本方法检测鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体和猪肺炎支原体最低均可检测到1—2 copies/μL；实际样本试验结果表明本研究建立的支原体qPCR检测方法与普通PCR、培养法有很好的一致性，且敏感性更高。【结论】建立的支原体通用qPCR检测方法，为细胞及病毒活疫苗中可能的支原体污染提供了一种准确可靠、且更加快捷的检测手段。

来源：《中国农业科学》