鼠衣原体(Chlamydia muridarum)免疫显性抗原主要外膜蛋白(MOMP)独特的同源三聚体结构

衣原体主要外膜蛋白(MOMP)因在外膜(OM)中丰度高、含有四个表面暴露的可变区(VD)且包含中和与血清分型表位以及恒定区(CD)中存在确认的T细胞表位，是一个有前景的亚单位疫苗候选抗原。然而重组及变性形式的MOMP未能引发与天然制备物相当的免疫应答，表明构象对免疫原性至关重要。研究人员在此报道了从感染性原体(EB)中分离的鼠衣原体(Cm)天然MOMP的两套冷冻电镜(cryo-EM)结构。EB MOMP形成独特的同源三聚体，具有由三个狭窄的非通透β-桶茎区以及展示VD的细胞外折叠抗原帽组成。在与构象中和抗体Fab片段的复合物中，抗原帽发生结构重排，显示了表位呈递如何受免疫结合调控。这些结构揭示了MOMP血清型特异性的分子基础，并为基于结构的疫苗设计提供了模板。

该研究发表于《Nature Communications》。衣原体是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，其细胞外感染性原体(EB)氧化性强、代谢活性极低，而网状体(RB)还原性强、代谢活跃并可复制，独特发育周期使得EB外膜刚性由二硫键交联的富半胱氨酸蛋白构成的衣原体外膜复合物(COMC)提供，而非肽聚糖层。主要外膜蛋白(MOMP)占EB外膜质量的约60%，形成同源三聚体，包含五个保守区(CD)和四个可变区(VD)，VD决定血清型，CD含T细胞表位，MOMP兼具黏附素与孔蛋白功能争议，是衣原体亚单位疫苗的首要候选抗原；但既往重组或变性MOMP无法诱导与天然三聚体相当的免疫保护，且缺乏高分辨率结构，衣原体遗传操作困难，制约了疫苗发展。研究人员以鼠衣原体(Cm)为模型（生殖器感染表型近似沙眼衣原体Ct对人生殖道的感染），开展了从感染HeLa-229细胞收获的Cm EB中，在还原条件下用CHAPS、Anzergent Z3-14去垢剂解聚COMC，经羟基磷灰石柱纯化得到天然MOMP三聚体；同时使用针对Cm EB产生的中和单克隆抗体mAb-18b（IgG2b/κ），经木瓜蛋白酶消化获得Fab片段并与MOMP孵育形成复合物；样本制备采用Quantifoil R 1.2/1.3 300目金栅格经辉光放电亲水化处理后，在Vitrobot Mark IV系统中制样（4°C、100%湿度、 blotting 5.0~5.5 s），分别在300 kV Titan Krios G2电镜配备K3 Summit直接电子探测器、GIF量子能滤片（狭缝25 eV）、SerialEM采集模式（束偏移九幅/台，欠焦?1.0~?3.0 μm，100帧/ movie，总剂量~80 e^?/?²，标定像素1.079 ?）进行冷冻电镜单颗粒分析(cryo-EM SPA)数据收集；主要关键技术方法包括：从Cm感染HeLa-229细胞分离的EB中还原纯化天然MOMP三聚体、制备mAb-18b单抗Fab片段并与MOMP形成复合物、cryo-EM SPA数据收集（300 kV Titan Krios G2/K3探测器）、CryoSPARC流程（补丁运动校正、补丁CTF校正、blob picker/Topaz深度学习挑粒、2D分类、ab initio重构、C3/C1对称性非均匀细化至2.96 ?（MOMP）和3.36 ?（复合物））、将AlphaFold2(AF2)预测模型对接至密度图后用Coot迭代构建并靠Phenix.real_space_refine和Servalcat精细化原子模型（CCPEM套件）、PyMOL/UCSF ChimeraX做静电势(APBS)、隧道分析(Caver)、界面互补(SC)、埋藏表面积(PISA)、保守作图(ConSurf)、结合亲和力预测(PRODIGY)、基于免疫表位数据库(IEDB)的表位映射与AlphaFold-Multimer同源建模（ColabFold）、AlphaFold3异源多聚体预测MOMP与COMC组分OmcA/OmcB互作。

研究结果如下：

Cm EB MOMP形成独特三聚体并暴露紧密折叠的抗原帽：研究人员通过C3对称性cryo-EM SPA重建得到全局分辨率2.96 ?的Cm EB MOMP结构，密度图中β-桶和胞外域侧链有序，跨膜区可见脂质/去垢剂密度标记膜边界，周质区有序度较低；每个原聚体为10股反平行β-桶（剪切数12，桶轴倾角~41°），跨膜区约占多肽40%，胞外结构域约占50%（含有序环、VD1~VD4、β-桶颈区暴露于溶剂及三聚界面β-片层），周质区约占10%（含富半胱氨酸柔性环与β-转角）；跨膜β-桶外侧疏水残基面向脂质双层、内侧极性残基朝桶腔，而胞外β-桶颈区极性反转（外侧极性、内侧疏水），符合可溶性球蛋白特征；三聚体靠胞外VD内及原聚体间氢键互作稳定抗原帽（每个原聚体VD1与同原聚体VD2及邻原聚体VD4互作，VD2与同原聚体VD3/VD4及邻原聚体VD4互作等），抗原帽有自身疏水核心，埋藏面积约10,000 ?²，帽总表面~22,000 ?²，帽使胞外延伸达~50 ?（单体OmpT类仅25~35 ?）；桶腔内发现Mg²⁺被D311(CD5)及五个水分子八面体配位，配位水网络涉及VD1、VD4残基，排除Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺（几何与散射不符），Mg²⁺指派与早期阳离子促进吸附观察一致；帽区还建模出N-乙酰葡糖胺(NAG，衣原体脂寡糖LOS常见组分)和月桂酸(DAO，Ct scavenged脂肪酸)，跨膜区下方原聚体间见脂类密度（建模为鞘磷脂介于两原聚体β-桶间，与A100、I333、A361疏水互作，埋藏面积各307/403 ?²，稳定三聚装配），未见明确LOS碎片高分辨密度；未发现Asn位有大型甘露糖型N-糖基化密度（与Ct报道不一致）；三聚体总互作埋藏~19,200 ?²（占表面31%），确认三聚体为功能单元；静电势显示胞外帽总体负电（Mg²⁺局部中和）、跨膜段中性带正口袋（磷脂/蛋白聚糖结合）、桶内跨膜区极性偏负电；C1重构与C3扩展3D分类未显示显著不对称，结构在C3下可靠。

EB MOMP跨膜区保守半胱氨酸残基：研究人员定位了八个Cys（C26、C29、C33在周质柔性环；C114在跨膜β-桶内；C179、C181在周质β-转角；C204在胞外VD2附近；C329在跨膜β-桶内），其中七个高度保守，C204种间不保守；样品为还原纯化条件故二硫键断裂，密度未见S–S，但空间上C26/C29/C33周质位足够接近可在氧化时形成原聚体内、三聚体间或与其它COMC蛋白（如OmcA、OmcB）的二硫键，C179-C181因紧β-转角难成分子内二硫键；跨膜C114与C329保守且侧链朝桶外脂质，未见实验β-桶蛋白有跨膜Cys（通常不稳定），但COMC二硫交联可能延伸至跨膜区，预测其他衣原体多态外膜蛋白(Pmp)家族也有跨膜向外Cys，暗示COMC稳定性由周质+跨膜二硫键共同介导；此结构解决了以往理论模型错误将Cys置胞外而与COMC周质二硫网络矛盾的问题，支持EB→RB氧化还原调控二硫键可逆形成参与COMC重构的发育转换模型。

mAb-18b Fab结合EB MOMP三聚体上构象表位：研究人员重建MOMP/mAb-18b Fab复合物至3.36 ?（Fab的V_H/V_L区3~3.5 ?，C_H/C_L因 elbow柔性>5 ?），化学计量1:1（三聚体结合三个Fab），每个Fab跨两原聚体：主要（~90埋藏面积）与原聚体1的VD1、VD2、VD4通过轻链CDR1/L1（与VD1¹、VD2¹氢键）、CDR3/L3（VD1¹、VD2¹）及重链CDR1/H1（VD2¹、VD4²）、CDR2/H2（VD1¹、VD2¹、VD4¹、VD4²）、CDR3/H3（VD1¹、VD2¹）互作，轻链L2不直接接触但R60 π-π稳定Y104(H3)趋近A145(VD2¹)；次要（~10%）与原聚体2的VD4²等互作；形状互补Sc=0.62，预估亲和ΔG≈?13.8 kcal·mol^?1（K_d~7.6 pM）；Fab结合诱导VD1(E61-E82)主链大重排（最大Cα位移~8 ?于D71），VD4(L284-T310)重排（S301-I309段位移，T307达~12 ?），β-桶跨膜区无变化；VD1/VD4重排破坏原先Mg²⁺配位（D311侧链旋转、I309侵入配位水位置），原Mg²⁺位点不能兼容结合后构象，与文献Mg²⁺降低抗体中和效率一致；密度支持VD1重排明确、VD4重排区部分无序（两残密度弱），选最适构象建模；结论是mAb-18b识别跨两原聚体VD构成的构象表位，结合致抗原帽局部重排、遮蔽宿主互作面，中和机制为空间位阻。

EB MOMP不能作为孔蛋白：研究人员发现尽管文献用脂质体溶胀/平面双层报道MOMP有~1~2 nm孔径、通透糖/ATP，但EB结构中每个原聚体β-桶（23×19 ?椭圆）腔内由N端前12残基形成部分螺旋“塞子(stopper)”从周质侧插入桶腔，与桶内极性残基形成~15个氢键并自身氢键，埋藏面积~2100 ?²，Caver分析探针0.9 ?找不到连续跨膜隧道——桶内有瓶颈（塞子区与侧链限制），胞外抗原帽无缝隙隧道；若去掉塞子和胞外域，仅剩跨膜β-桶最小直径~4.3 ?（仅通水，不通糖/ATP）；桶内见有序水分子（由塞子P2羰基、Q189、Q249配位），证明塞子在折叠时 trapped 水，说明塞子为折叠中间稳定β-桶、防止非生产通透；即便EB→RB还原二硫键，塞子仍稳固插入，仅靠还原不能打孔；故EB态MOMP不是功能孔蛋白，既往通透数据可能来自污染孔蛋白或重组错误折叠；若RB态MOMP需通透，须采取不同于EB的β-桶拓扑/重折叠（如移除塞子重新折叠），或别的蛋白执行孔蛋白功能；EB MOMP主要角色是COMC结构组件+抗原帽黏附相关。

VD与亚单位疫苗开发、黏附模型：研究人员指出VD1/VD2/VD4在抗原帽表面暴露，帽带负电但有正电沟槽/口袋（一处结合NAG、一处结合DAO、Mg²⁺位点邻近VD1/VD4），可结合宿主硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GAG)实现初始可逆吸附（多门控黏附模型第一步）；物种间保守非肽基基序（Ct为TTLNPTIAG，Cm为TTWNPTISG，位于VD4）在结构中深埋于三聚界面并参与Mg²⁺水网/NAG结合，并非溶剂暴露；mAb-18b结合后下游VD4(S301-T310)重排可局部暴露此基序，提示宿主受体结合可能诱导抗原帽构象变化暴露此基序实现不可逆黏附（第二步），低温阻断黏附即阻断此重排；基序虽保守但单独免疫原性差，需侧翼VD上下文折叠才有免疫原性（CTH522疫苗含extVD4）；抗原帽由三个原聚体所有VD折叠为统一结构域，表面暴露序列高变（VD是免疫显性B细胞表位区），种内保守CD在桶/周质/T细胞表位富集；三聚放大微小序列差异→协同三级/四级结构、电荷、动力学变化→血清型特异性黏附与免疫识别；B细胞表位（IEDB映射Ct D血清型同源模型）富集胞外帽VD区，T细胞表位在保守CD/β-桶；结构上mAb-18b表位跨VD1/VD2/VD4，是首个解析的MOMP构象B细胞表位；以往嵌VD到奈瑟菌PorB等三聚β-桶支架失败因无法重现抗原帽折叠与构象表位；此结构可做模板用深度学习优化序列（删非必需Cys、稳定三聚折叠）、设计保留构象表位的重组三聚体或移帽至合适支架，提升交叉保护亚单位疫苗。

讨论部分总结：研究人员指出EB MOMP结构是独特的“3×β-桶＋1个共享抗原帽”三聚体架构（非“3+0”如OmpT类单体三聚β-桶，也非“3+3n”），抗原帽无已知结构同源，代表一类新型三聚黏附素家族；帽结合Mg²⁺、正电穴带配体（NAG、脂肪酸、鞘磷脂插于原聚体间），鞘磷脂互作呼应衣原体依赖宿主鞘脂；结构推翻以往16股/14股β-桶理论模型；EB态塞子+抗原帽封堵桶，不支持孔蛋白功能，既往通透数据需重评（污染或RB特异态/其它蛋白负责孔道）；还原纯化样品保持EB天然折叠（Fab结合验证），EB MOMP三聚体在还原状态仍稳定，二硫键主要在周质/跨膜区介导原聚体间/COMC交联（Cys空间不支持原聚体内/三聚内二硫），跨膜保守Cys提示氧化还原调控延至膜内，EB（二硫交联COMC刚性）—RB（还原、COMC松弛、MOMP三聚/单体保留、再氧化EB成熟）发育转换中还原是早期启用步骤但不是唯一触发，需伴随核凝聚解聚代谢重启；抗原帽负电/正沟可初接GAG，帽构象重排（如受体触发）暴露VD4保守基序等介导特异不可逆黏附，三聚放大VD序列变异为血清型特异性黏附与免疫逃逸（免疫显性变异储）的结构基础；结构上B细胞表位在帽VD（构象依赖），T细胞表位在保守区，疫苗设计须保留天然三聚构象与帽折叠（非仅线性VD肽），可借助此模板做深度学习序列优化与帽移植；该cryo-EM结构为衣原体粘附机制解析、COMC组装模型（AF3预测MOMP与OmcA/OmcB周质多二硫互作、OmcB叁聚星状支架替代肽聚糖）、EB→RB结构转换、血清型特异性免疫显性等提供原子模板，尤其推动基于结构的MOMP亚单位疫苗理性设计；论文发表于《Nature Communications》。