肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP）是儿童社区获得性肺炎的主要病因，然而关于鼻咽部微生物群失调在感染易感性和疾病亚型中的作用尚不清楚。在本研究中，研究人员对102例儿童MPP患者、104例甲型流感患者和103例健康对照的鼻咽部样本进行了16S rRNA测序，并比较了各组之间的微生物多样性、组成和功能特征。MPP组表现出改变的鼻咽部微生物组成，其特征为微生物多样性降低，以及支原体属（Mycoplasma）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和坦纳菌属（Tannerella）等属相对丰度增加。MPP亚型具有不同的微生物群特征，其中支原体属在支气管肺炎（bronchopneumonia, BP）中的丰度高于大叶性肺炎（lobar pneumonia, LP）。研究人员基于鼻咽部微生物群的相对丰度建立了微生物分类器，用于区分MPP患者与流感患者及健康对照，其受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curves, AUC）为0.978。与MPP相关的关键微生物特征包括支原体属、分枝杆菌属（Mycobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）和不动杆菌属。此外，基于PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2）的功能预测表明，MPP患者中氨基酸代谢以及预测的与细菌感染和抗菌药物耐药相关的功能通路发生改变。总之，本研究为儿童MPP鼻咽部微生物群的变化提供了全面的认识。这些发现突显了微生物群失调在疾病进展中的潜在作用，并表明微生物群组成和功能特征的变化与MPP感染相关。
本研究旨在阐明儿童肺炎支原体肺炎（MPP）患者上呼吸道（upper respiratory tract, URT）微生物群失调的特征及其与疾病亚型的关联，论文发表于《Microorganisms》期刊。
研究背景方面，肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是最小的无细胞壁自我复制原核生物，基因组大小约为800 kb，是急性呼吸道感染的主要病原体，占报告病例的18.6%。MPP主要通过呼吸道飞沫传播，占儿童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）病例的20%至40%。尽管大多数感染为轻症且具有自限性，但部分病例可进展为重症或危重症，伴有危及生命的肺外并发症。呼吸道微生物群在健康个体中通常处于平衡状态，对维持宿主防御和防止病原体定植起着关键作用。病原体、环境变化或免疫紊乱等因素破坏这种平衡可导致微生物群失调和症状性感染，包括肺炎。越来越多的证据表明，呼吸道微生物群的变化与急性呼吸道感染（acute respiratory infections, ARIs）如毛细支气管炎和肺炎相关。作为儿童常见的下呼吸道感染（lower respiratory tract infection, LRTI），MPP与下呼吸道微生物群失调有关。近年来，多项研究探索了微生物群在MPP发生发展中的作用，揭示了其与肠道、肺部、鼻咽部（nasopharyngeal, NP）或口咽部（oropharyngeal, OP）微生物群的潜在关联。上呼吸道，特别是具有高微生物密度的鼻咽部，是呼吸道感染的关键微环境。鼻咽部不仅代表气道微生物群，也是通过微生物交换形成肺部微生物群的重要来源。以往研究已证实急性呼吸道感染期间鼻咽部和口咽部微生物群的变化，提示这些区域之间可能存在微生物传播。然而，专门针对儿童MPP进展中上呼吸道微生物群作用的研究较少，现有研究往往样本量小或并非以儿童为研究对象。因此，全面分析MPP儿童鼻咽部微生物群对于理解微环境变化及相关功能基因改变至关重要。
研究人员开展了以下研究：纳入102例MPP儿童患者、104例甲型流感患者和103例健康对照，所有样本在同一呼吸道感染季节（2023年11月至2024年1月）采集。采用16S核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）测序技术分析鼻咽部微生物群，评估微生物多样性、细菌相对丰度和功能基因特征，以期表征MPP特有的微生物景观及其与疾病亚型的相关性。
研究得出以下主要结论：MPP患儿鼻咽部微生物群存在显著的结构和功能性改变，表现为微生物多样性降低、潜在机会性病原体富集、以及与大叶性肺炎和支气管肺炎不同临床亚型相关的微生物特征差异。具体而言，支气管肺炎病例中支原体属的相对丰度显著高于大叶性肺炎；基于鼻咽部微生物群构建的随机森林分类器可高效区分MPP患者、流感患者和健康对照；功能预测显示MPP患者氨基酸代谢及与细菌感染和抗菌药物耐药相关的通路发生改变。这些发现揭示了鼻咽部微生物群失调在MPP发病机制中的潜在作用，为理解疾病异质性和微生物群与呼吸道感染的关联提供了新的视角，并为未来开发基于微生物群的诊断标志物和治疗策略奠定了基础。
研究采用的关键技术方法包括：样本来源于浙江大学医学院附属儿童医院招募的儿科参与者，包括102例MPP患者、104例甲型流感患者和103例健康对照，样本于2023年11月至2024年1月同期采集；采用16S rRNA基因V1-V9区全长PacBio Sequel II平台测序；生物信息学分析方面，使用SMRT Link Analysis v9.0生成环化一致性序列（circular consensus sequence, CCS），UPARSE v7.1进行98.65%相似度的操作分类单元（operational taxonomic units, OTU）聚类，RDP Classifier v2.2基于Silva 16S rRNA数据库（SSU132）进行物种注释；alpha多样性采用Shannon指数，beta多样性采用Bray-Curtis距离的主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA），组间差异采用置换多变量方差分析（PERMANOVA），并使用多元回归模型校正年龄和性别；线性判别分析效应量（LEfSe）分析用于识别差异富集菌群；基于随机森林（random forest, RF）模型构建微生物分类器，采用嵌套五折交叉验证，以平均准确度下降值（mean decrease accuracy, MDA）评估变量重要性；功能预测采用PICRUSt2（v2.6.3）基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）数据库进行。
研究结果部分按以下小标题展开：
**研究参与者特征**：三组在年龄上存在显著差异（p < 0.001），但性别分布无显著差异（p = 0.4）。MPP患者的白细胞和中性粒细胞计数显著高于流感患者和健康对照（p < 0.05）。C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）在MPP患者中水平更高（p < 0.05）。中性粒细胞计数、单核细胞计数、中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio, NLR）、血小板与淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio, PLR）以及单核细胞与淋巴细胞比值（monocyte to lymphocyte ratio, MLR）在MPP和流感患者中均显著高于健康对照（p < 0.05）。ROC曲线分析显示中性粒细胞计数和NLR具有最佳的区分效能，AUC值大于0.64。
**MPP患者鼻咽部微生物群改变**：在门水平上，MPP微生物群以厚壁菌门（Firmicutes, 48.8%）、变形菌门（Proteobacteria, 26.9%）、放线菌门（Actinobacteriota, 13.3%）和拟杆菌门（Bacteroidota, 5.4%）为主。在属水平上，MPP患者中支原体属（22.6%）、葡萄球菌属（Staphylococcus, 15.8%）和链球菌属（Streptococcus, 13.9%）占主导，而流感患者以莫拉菌属（Moraxella）和链球菌属为主，健康对照以莫拉菌属和嗜血杆菌属（Haemophilus）为主。MPP患者的alpha多样性（Shannon指数）显著低于流感患者和健康对照（p < 0.001），表明alpha多样性降低。Beta多样性分析（PCoA）显示组间存在显著差异（p < 0.05），证实了MPP患者存在鼻咽部微生物群失调。经年龄和性别校正后，上述结果保持一致。MPP患者不同年龄（≤5岁和>5岁）和性别的亚组分析显示，较小年龄组（≤5岁）葡萄球菌属相对丰度显著更高（p = 0.046），但性别间无显著差异。LEfSe分析鉴定出MPP患者中富集的属包括支原体属、假单胞菌属、气单胞菌属和肠杆菌属（Enterobacter），而流感患者中多尔西菌属（Dolosigranulum）和冢村菌属（Tsukamurella）富集，健康对照中卟啉单胞菌属（Porphyromonas）和梭杆菌属（Fusobacterium）富集。MPP患者特有的较高丰度菌群包括支原体属、假单胞菌属、不动杆菌属、坦纳菌属、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、丛毛单胞菌属（Comamonas）和黄杆菌属（Flavobacterium），以及较低丰度的多尔西菌属和异普雷沃菌属（Alloprevotella）。
**鼻咽部微生物群与MPP亚型的关联**：MPP分为大叶性肺炎（LP, n = 83）和支气管肺炎（BP, n = 19）以探索微生物群与亚型的关联。两组间alpha多样性无显著差异（p > 0.05），即使经年龄和性别校正后仍无显著差异（校正p = 0.0649）。然而，beta多样性分析显示群落组成存在显著差异（p = 0.001），校正后依然显著（校正PERMANOVA, p = 0.001）。LEfSe分析揭示了两亚型间不同的微生物特征：BP患者表现出显著更高的支原体属、脱硫弧菌属、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、乔治菌属（Georgenia）和威廉菌属（Williamsia）丰度，而LP患者中[Eubacterium]_brachy_group丰度更高。厚壁菌门在BP组显著多于LP组，支原体属在BP中显著更高（p < 0.001）。ROC分析显示支原体属可区分LP和BP，AUC为0.812，提示其作为区分这两种MPP类型诊断标志物的潜力。
**MPP微生物分类器的鉴定**：研究人员构建了含500棵树的随机森林模型以识别MPP相关微生物标志物，袋外（out-of-bag, OOB）错误率为0.11。模型鉴定出贡献最大的前15个属。在主模型中，混淆矩阵显示102例MPP中92例、104例流感中87例、103例健康对照中85例被正确分类。ROC分析显示卓越的分类性能：MPP的AUC为0.978（95%置信区间[confidence interval, CI]: 0.959–0.997），流感为0.956（95% CI: 0.935–0.977），健康对照为0.954（95% CI: 0.933–0.976）。在0.5概率阈值下，敏感性/特异性分别为0.853/0.995（MPP）、0.788/0.917（流感）和0.757/0.942（健康对照）。与健康对照相比，MPP患者表现出较高的支原体属、分枝杆菌属、气单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、杰米拉菌属（Gemella）、莱因海默拉菌属（Rheinheimera）和脱硫弧菌属丰度，以及较低的莫拉菌属、嗜血杆菌属、罗斯菌属（Rothia）、多尔西菌属和卟啉单胞菌属丰度（p < 0.05, Kruskal-Wallis检验）。为评估年龄不平衡的潜在影响，研究人员构建了年龄残差化后的随机森林模型，整体分类性能与主分析高度一致，正确分类87例MPP、86例流感和85例健康对照，AUC值分别为0.931（MPP）、0.936（流感）和0.928（健康对照）。为确定分类性能是否仅由支原体属丰度驱动，排除该属后重复分析，分类性能中度下降但仍保持较高判别能力，正确分类80例MPP、87例流感和85例健康对照，AUC值分别为0.949（MPP）、0.944（流感）和0.937（健康对照）。
**与MPP相关的鼻咽部微生物群预测功能潜力**：MPP患者鼻咽部微生物群表现出更高的氨基酸代谢潜力，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸代谢，其中甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸代谢通路在MPP患者中特异性富集。此外，MPP患者微生物群在外源性化合物生物降解和代谢通路（包括苯乙烯、糠醛、苯甲酸和甲苯降解）显著富集，而药物代谢通路下调。相反，流感患者表现出更高的能量代谢潜力（如氧化磷酸化和光合天线蛋白）。"}}"
