肠道将营养消化与吸收同免疫监视相整合，持续面临膳食抗原、共生微生物群和病原体的挑战。其高度区域化的结构要求免疫系统在对食物和共生生物的耐受与针对病原体的保护性应答之间取得平衡，产生跨越多个空间尺度的显著异质性和复杂性，使其本质上难以研究。传统技术如流式细胞术、免疫组织化学和RNA测序能够表征免疫细胞的位置、组成和转录状态，但无法同时且无偏倚地探究细胞状态与空间背景。在过去十年中，空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）使研究人员首次能够无偏倚地对原位基因表达进行 profiling。本综述中，研究人员讨论了空间转录组学用于肠道免疫系统分析的适用性、利用该技术取得的关键发现、互补技术、当前挑战及其在肠道免疫学研究中未来应用机遇。
空间转录组学技术的分类与原理
空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术可根据其方法学框架分为基于成像（imaging-based）和基于测序（sequencing-based）两大类，并按其分辨率高低进一步区分。基于成像的平台包括多重误差稳健荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH）、Xenium和CosMx空间分子成像仪（CosMx spatial molecular imager, CosMx SMI）等，通过荧光显微镜和迭代杂交直接在组织切片内检测RNA分子，可达到细胞或亚细胞分辨率。基于测序的方法则依赖空间条形码策略，将带有位置编码的转录本进行测序后计算分配至原始组织坐标，代表平台包括Visium v1/v2或HD、Slide-seq、Stereo-seq和OpenST等。这些技术在空间分辨率、转录组覆盖度和可扩展性方面各具优势与固有限制。基于spots的方法缺乏单细胞分辨率，每个spot捕获多种细胞类型的混合物，难以在密集的肠道上皮中得出细胞-细胞相互作用的结论，因此需要借助反卷积算法（如Cell2location、RCTD）进行准确的细胞类型注释。基于成像的平台虽可实现真正的单细胞分辨率，但高表达基因（如IgA）可导致光学拥挤，阻碍准确信号定量。样本制备是另一关键考量，新鲜冷冻与FFPE（formalin-fixed paraffin-embedded）组织的选择会影响平台适用性；基于探针的平台（如CosMx SMI、MERSCOPE、Xenium）通过靶向特定序列而非依赖全长转录本完整性，更适合临床和存档样本。
空间转录组学在肠道研究中的关键发现
肠道空间组织架构的解析：空间转录组学已实现细胞类型和基因表达的无偏映射。一项研究重建了人类肠道从胚胎到成年的发育过程，揭示了免疫、血管和上皮区的出现与空间组织，鉴定了WNT、NOTCH和TGFβ等关键肠道模式信号，并发现免疫细胞在胎儿小肠中更为丰富，尤其ILC3（group 3 innate lymphoid cell, ILC3）细胞丰度较高，同时鉴定了T细胞、B细胞和基质细胞在Peyer斑形成过程中的共定位细胞邻域。Harnik等结合10x Visium空间转录组学、CODEX（co-detection by Indexing）空间蛋白质组学和单分子FISH（fluorescence in situ hybridization），构建了成人近端小肠的全面空间图谱，揭示了脂质和铁代谢基因沿隐窝-绒毛轴的差异分布，以及γδ T细胞和巨噬细胞向绒毛顶部的募集。针对长期以来被认为相对均质的结肠，ST技术挑战了这一观点。研究者将小鼠 elongated 管状结肠盘绕成螺旋状以最大化Visium slides上的可用spots，同时保留整个近端-远端轴的连续空间信息，鉴定了主要组织区室及此前未被认知的结肠分子区域化。
免疫细胞与其他细胞类型的相互作用：ST为表征微环境功能/形成相关分子（如细胞因子、配体和受体）提供了机会。Reina-Campos等应用基于成像的ST追踪转移的TCR转基因CD8 T细胞（P14 T细胞），解析了小肠中组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cell, TRM）分化沿肌肉-肠腔轴的空间需求。研究发现，标记Tcf7的前体样P14 T细胞定位于绒毛基部，邻近B细胞、CD4 T细胞、成纤维细胞和前体上皮细胞；而表达Gzma和Gzmb的终末分化效应P14 T细胞则位于绒毛尖端，靠近上皮细胞和自然杀伤细胞。结合沿隐窝-绒毛轴差异分布的细胞因子和趋化途径（如TGFβ、MAdCAM-1），提示CD8 TRM极化通过局部信号在淋巴组织 priming 后得以维持。研究人员还开发了光学编码CRISPR敲除方法，研究TGFβRII和CXCR3缺失对P14 T细胞定位和极化的影响，展示了ST在机制性描述特定受体在细胞定位中作用的灵活性。Frede等结合scRNA-seq和ST，发现B细胞会破坏telocyte、Bmp5+基质细胞与上皮细胞之间的通讯，在黏膜愈合中发挥有害作用。
炎症期间的空间免疫结构：将ST应用于炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）患者样本和结肠炎模型，扩展了表征炎症、狭窄或再生相关区域细胞位置的能力。CosMx被用于描述IBD患者发炎上皮中炎症依赖性替代型巨噬细胞（以GPR183、HLA-DMB和CYBB等为标志）与炎症性成纤维细胞（以CXCL5、IL7R和IL11为标志）的共定位。对狭窄型克罗恩病（Crohn's disease）患者的scRNA-seq图谱反卷积Visium数据，鉴定了浆细胞和淋巴滤泡在狭窄区的富集，以及炎症性成纤维细胞与溃疡或退化上皮的邻近关系。Parigi等应用降维技术绘制了葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate, DSS）诱导结肠炎后协调且空间受限的表达变化，定义了再生、角质化或危险应答区域。Cadinu等应用基于成像的ST表征组织重塑过程中的新兴细胞群体，鉴定了炎症相关上皮状态以及单核细胞、Cxcl10+巨噬细胞、肠腔中性粒细胞和CD8+ T细胞的空间受限扩增。近期研究利用RBhigh T细胞转移模型和Il10-/-自发性慢性结肠炎模型，展示了同时发生于结肠多个空间位置的多种不同炎症程序，表明肠道炎症并非均一过程，而是由区域特异性应答构成的镶嵌体。
结直肠癌中的肿瘤结构：空间分析对于理解肿瘤-免疫相互作用及结直肠癌（colorectal cancer, CRC）等肠道恶性肿瘤的转化过程演变至关重要。Valdeolivas等利用ST绘制了CRC的共有分子亚型和免疫通路图谱，突出了该技术解析过渡状态的能力。高分辨率方法鉴定了位于不同生态位的巨噬细胞亚群（SPP1+和SELENOP+），并结合基于成像的ST在肿瘤外周进行了T细胞克隆型映射。Avraham-Davidi等对Apc缺失的两种小鼠模型进行表征，鉴定了恶性区域具有共享免疫组成但在发育不良病变部位存在不同上皮程序的区域，并与CRC患者区域进行了比较。
微生物组-免疫细胞空间相互作用：ST可定位微生物群缺失或存在触发的基因表达变化，揭示宿主细胞与微生物组之间的局部相互作用热点。在空间分析中，发现小肠杯状细胞和结肠细胞亚群形成富含Muc2和Ceacam20的结构化细胞黏附层，提示宿主-微生物通讯通过空间定义的上皮生态位介导。深入黏膜，感知微生物来源代谢物的受体在SPF（specific-pathogen-free）和GF（germ-free）小鼠小肠和结肠的巨噬细胞中沿隐窝呈现差异表达，表明微生物信号以空间受限方式塑造局部免疫细胞分化程序。干扰素刺激基因在个体绒毛和隐窝中呈现微生物依赖性的空间斑块状表达模式，延伸至小肠和大肠，指向黏膜表面局部化而非均一的免疫激活。在区域水平，结肠中段似乎对微生物信号尤为敏感，非相邻肠道区域共享溶质载体转运蛋白的表达模式，提示其肠腔微环境具有共享特征。
超越空间转录组学的综合肠道视角
空间宏转录组学（spatial metatranscriptomics, SmT）、空间宿主-微生物组测序（spatial host-microbiome sequencing, SHM-seq）和原位polyadenylation策略等技术可在宿主基因表达旁检测微生物转录本。原位polyadenylation已应用于研究细菌reads的分布及特定细菌物种存在时宿主的应答，以及细菌分布在肌肉-肠腔轴和肿瘤-微生物界面的变化。空间代谢组学（如质谱成像，mass spectrometry imaging, MSI）可直接可视化和定量组织切片中的小分子，反映内源性细胞过程和外源性环境输入。例如，空间代谢组学揭示了沿隐窝-绒毛轴的代谢梯度。空间VDJ测序（spatial VDJ sequencing）可在空间背景下研究免疫克隆多样性，未来可用于分析维持免疫耐受的IgA+浆细胞、与肠道炎症相关的IgG浆细胞，以及监视肠道感染和肿瘤的T细胞。三维空间分析是另一前景方向，OpenST可将flow cells转换为ST捕获区域，从连续切片获取数据重建3D block。其他方法包括Deep-STARMap、Deep-RIBOmap和DNA-microscopy等。
空间转录组学的临床应用前景与挑战
ST向临床转化的障碍包括高昂成本、专业化组织处理和巨大计算需求。样本获取中的临床流程变异性（样本类型、固定、FFPE包埋、储存，或缺乏自动化和标准化）可能影响跨团队和中心的可比性。短期内，ST可作为发现平台，识别诊断和预后生物标志物。整合大规模空间数据集可能揭示与治疗应答、疾病进展或病理细胞状态相关的基因特征，进而转化为更易获取的检测方法（如原位杂交、免疫荧光或成像质谱流式）。人工智能模型应用于常规组织病理学图像，可能直接从组织形态学预测基因表达模式或疾病内型，特别是在癌症中。例如，从H&E预测的空间转录组学已被证明在乳腺癌中可匹配或优于bulk RNA-seq方法的生存预测。空间衍生的ecotypes也可通过血浆中细胞游离DNA的甲基化分析进行预测，并与不同癌症类型的患者生存相关。
未来展望
空间转录组学代表了绘制肠道环境复杂性的最强大方法之一。其在黏膜免疫学中的整合有望推动该领域向更准确的描述发展，指向机制性和临床可操作的见解。通过保留空间背景，ST能够识别在bulk或单细胞方法中常被忽略的位置特异性疾病 vestibule 过程，在IBD或CRC中可能允许识别潜在致病性细胞相互作用。将基因表达锚定于物理位置，可以绘制肠道中免疫细胞定位的驱动因素、微环境如何影响转录程序，以及这些程序在健康、疾病或扰动下如何调控。此外，与微生物组和代谢组分析的整合将能够捕捉宿主细胞、微生物组和肠腔代谢物之间的 interplay，深化对肠道景观中免疫生态位多层本质的理解。
