同源重组通过从完整的DNA模板复制遗传信息来修复DNA双链断裂（DSB，最严重的DNA损伤类型之一），但在庞大的三维基因组中如何定位同源序列仍不清楚。在此论坛中，研究人员探讨了关键的染色质组织者——黏连蛋白（一种介导姐妹染色单体黏连的保守环状蛋白质复合物）如何在哺乳动物细胞的DNA修复过程中引导同源搜索。
在基因组稳定性维持中，DNA双链断裂（DSB，最严重的DNA损伤类型之一）的修复至关重要。同源重组（HR，利用同源序列作为模板进行DNA损伤修复的途径）通过从位于姐妹染色单体、同源染色体或非等位基因座上的完整同源序列复制来修复受损DNA。在此过程中，辐射敏感蛋白51（RAD51，一种重组酶）在DSB相邻的单链DNA上聚合形成核蛋白丝，即突触前丝，进而执行同源搜索。然而，鉴于基因组包含数十亿个碱基对，且姐妹染色单体并不总是完美对齐，相应的姐妹基因座可能相距甚远，HR机制如何在庞大的三维基因组中高效定位匹配序列一直不甚明了。由于DSB并不总是使用姐妹染色单体作为模板，亟需阐明促进有效同源搜索的机制。研究人员探讨了黏连蛋白（一种介导姐妹染色单体黏连的保守环状蛋白质复合物）在HR中的确切作用。以往模型认为它只是被动连接姐妹染色单体的环，但新研究揭示它也是一种能主动挤出DNA环的分子马达。这项研究旨在探究黏连蛋白如何导航同源搜索。研究结果表明，黏连蛋白通过物理连接姐妹染色单体和动态挤出染色质环，将随机搜索转化为定向搜索，从而显著加速HR修复。该论文发表在《TRENDS IN Cell Biology》，为基因组三维组织与DNA修复的交互提供了全新视角，对理解黏连蛋白病和癌症的病理机制具有深远意义。
为开展此项研究，研究人员运用了多种前沿技术。Teloni等人开发了sister-pore-C技术，该技术结合S期BrdU标记与pore-C（结合染色质构象捕获和纳米孔测序），以绘制DSB发生前后复制染色体的染色质内和染色质间接触图谱。研究还利用染色质免疫沉淀测序测量RAD51分布，以及利用RaPID-seq（一种敏感的定位人类细胞中RAD51候选搜索模板的方法）分析模板采样范围。单分子成像和体外实验用于探究核蛋白丝对双链DNA的长度识别及多价接触机制。样本队列主要来源于人类细胞系和酵母等模式生物的实验模型。
**挤出染色质环的黏连蛋白在RAD51介导的同源搜索中的作用**
通过sister-pore-C技术，研究人员发现DSB会招募介导姐妹染色单体黏连的黏连蛋白，将RAD51丝状物束缚在姐妹染色单体附近。耗竭loop-extruding cohesin（挤出染色质环的黏连蛋白）会缩小RAD51分布范围并延迟DNA修复。实验显示，RAD51丝状物在拓扑关联结构域（TAD，DNA内部相互作用频率高于邻近区域的染色质区域）边界内对同源序列进行采样。这表明染色质环挤出扩大了RAD51丝状物在TAD边界内的搜索范围。此外，DSB诱导了依赖于黏连蛋白的染色质环在断裂位点附近形成，这些断裂锚定的染色质环在HR活跃的S期和G2期形成。Marin-Gonzalez等人提出，loop-extruding cohesin通过在局部TAD内进行定向扫描促进同源搜索，使RAD51丝状物的搜索模式更接近一维扫描而非三维搜索。他们还证实，RAD51广泛的染色质免疫沉淀测序谱是同源搜索的真实测量指标，且loop-extruding cohesin以距离依赖的方式促进HR，引导同源搜索趋向受损的TAD。Friskes等人的活细胞成像研究进一步提出，黏连蛋白在HR中的关键作用独立于CCCTC结合因子（CTCF，一种限制染色质环挤出的DNA结合蛋白）锚定的DNA环。另外，体外实验揭示，dsDNA靶标的三维构象和核蛋白丝长度在同源搜索中至关重要，核蛋白丝通过多价特性利用多个弱接触进行三维搜索。单分子成像表明，长度识别机制在dsDNA询问过程中起作用，能够选择8个核苷酸的微同源束。RaPID-seq揭示人类细胞优先进行局部而非全基因组的同源搜索。
在讨论与结论部分，研究人员总结了同源搜索的分子细节，指出其不再像“大海捞针”般随机。有力证据支持黏连蛋白通过缩小搜索空间提升同源搜索效率，loop-extruding cohesin则促进了RAD51核蛋白丝与染色质的长距离相互作用。研究人员还比较了其他重组过程，指出在V(D)J重组和免疫受体基因重排中，loop-extruding cohesin同样将远端DNA片段拉近，机制与HR相似；在减数分裂中，由PRDM9蛋白靶向特定序列产生的程序性DSB，其位点在发生前即可被预先定位，这种预定位可能提高减数分裂同源搜索的效率。最后，研究提出了若干未解问题：哺乳动物细胞中DSB处的黏连是重新建立还是重定位？染色质环挤出是否可能将DNA拉出黏连蛋白环从而破坏姐妹染色单体黏连？鉴于黏连蛋白属于结构维持染色体（SMC，从细菌到人类保守的蛋白家族）复合物，Condensin和SMC5/6复合物也参与DNA挤出和HR修复，理解黏连蛋白的作用有助于揭示其他SMC复合物的功能。由于黏连蛋白亚基突变导致黏连蛋白病并在癌细胞中频发，且HR缺陷与癌症治疗敏感性相关，例如STAG2缺陷与HR必需基因产生合成致死相互作用，因此该研究为黏连蛋白病和携带黏连蛋白突变的癌症提供了重要的治疗启示。
