铜死亡（Cuproptosis）是一种新近发现的铜依赖性细胞死亡形式，参与多种生理和病理过程。然而，涉及的执行蛋白以及生理性细胞内铜在铜死亡中的作用仍不清楚。在此，研究人员将肌球蛋白重链9（MYH9）鉴定为铜死亡执行蛋白。铜结合诱导MYH9聚合，从而破坏肌动蛋白细胞骨架并导致铜死亡。研究表明，己基2-(3,4,5-三羟基苯基)乙酸酯（HThPA）通过结合核受体Nur77诱导铜死亡，导致铜螯合剂谷胱甘肽（GSH）耗竭，并从细胞内铜储存库释放游离铜。乙酰转移酶二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）介导的MYH9乙酰化促进了铜的结合，无论铜来源于细胞外还是细胞内。耐药肿瘤细胞和临床样本中的生理性铜水平较高，这增加了HThPA诱导铜死亡的可能性。这些结果阐明了铜死亡的机制，确立MYH9为执行蛋白，并提出了一种针对耐药肿瘤的治疗策略。
**研究背景与问题**
铜是调控多种生理过程的重要细胞因子。过量铜在线粒体中与硫辛酰化蛋白结合，导致铁硫簇相关蛋白异常聚集和降解，从而引发铜死亡（cuproptosis）。此前的已知机制集中于铜通过铜离子载体（如elesclomol和双硫仑）从外源转运进入细胞，干扰线粒体代谢可降低细胞对铜死亡的敏感性，而抑制低氧诱导因子-1α则可促进铜死亡。然而，焦亡等细胞死亡类型已有明确的执行蛋白，铜死亡却尚未鉴定出对应的执行者。此外，生理性或病理性条件下细胞内铜如何参与铜死亡诱导的机制也基本未知。基于这些空白，研究人员开展了本研究。
**研究内容与结论**
研究人员将肌球蛋白重链9（MYH9）鉴定为铜死亡执行蛋白。铜与MYH9结合后诱导其发生聚合，破坏肌动蛋白细胞骨架，最终导致细胞死亡。二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）在胞质中乙酰化MYH9，增强铜结合并促进聚合。研究人员还发现化合物己基2-(3,4,5-三羟基苯基)乙酸酯（HThPA）能够通过核受体Nur77耗竭谷胱甘肽（GSH），动员细胞内铜储存池的游离铜，从而经MYH9依赖途径诱导铜死亡。由于耐药肿瘤细胞和临床耐药患者样本中铜水平更高，HThPA对耐药肿瘤表现出更强的杀伤效果，且与化疗药物联用具有协同抑制肿瘤的作用。该研究从机制上确立了MYH9作为铜死亡执行蛋白的地位，并提出通过动员细胞内铜治疗耐药肿瘤的新策略。论文发表在《Cell》。
**主要关键技术方法**
研究使用了多种方法，包括：非还原SDS-PAGE结合质谱鉴定铜诱导的蛋白聚合物；CRISPR-Cas9基因敲除和shRNA敲低；免疫沉淀、体外乙酰化/磷酸化实验；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测总铜、游离铜和MYH9结合铜；F-actin/G-actin分离实验和Triton X-100不溶组分分析；X射线晶体学解析Nur77配体结合域与HThPA复合物结构；小鼠异种移植瘤模型、患者来源异种移植瘤（PDX）模型、基因工程小鼠模型（如Cldn18-ATK胃癌模型、Nur77敲除小鼠原发性肝癌模型）和临床胃癌、肝癌样本分析。
**研究结果**
*MYH9聚合对铜死亡至关重要*
通过非还原SDS-PAGE和质谱分析，研究人员在铜离子载体处理的黑色素瘤A375细胞及体外铜孵育的细胞裂解液中鉴定到MYH9为最丰富的聚合蛋白。多种铜离子载体处理均可诱导MYH9聚合，而铜螯合剂可逆转该效应。MYH9敲除显著抑制铜离子载体诱导的球形细胞形态、ATP下降和细胞死亡。铜直接结合MYH9，且仅铜而非其他金属离子诱导聚合。在A375异种移植瘤模型中，DSF-Cu或ES-Cu显著抑制肿瘤生长并伴随瘤内MYH9聚合，而MYH9敲低则削弱抑瘤效果。在血红素缺乏诱导的急性髓系白血病OCI-AML3细胞模型中，敲除亚铁螯合酶（FECH）或使用N-甲基原卟啉IX（NMP）同样引起MYH9依赖的铜死亡。光遗传学工具CRY2olig融合MYH9后，蓝光照射直接触发MYH9聚合和细胞死亡。因此，铜诱导的MYH9聚合是铜死亡的前提，MYH9可能是铜死亡的执行蛋白。
*DLAT介导的MYH9乙酰化增强铜结合*
铜离子载体处理导致线粒体基质蛋白DLAT和HSP60释放至胞质，且不依赖BAK/BAX。胞质DLAT与MYH9 C端结合，并发挥乙酰转移酶活性，在体外和细胞内催化MYH9乙酰化。DLAT敲低或酶失活突变DLATD624A均削弱铜诱导的MYH9乙酰化、铜结合和聚合。乙酰化通过中和MYH9铜结合位点（Cys896和Cys1834）附近赖氨酸的正电荷，降低静电排斥，从而促进正电铜离子的结合。进一步确定Cys896和Cys1834为铜配位关键残基，突变后（MYH92CS）铜结合和聚合消失，在体内亦不能抑制肿瘤生长。
*MYH9通过破坏肌动蛋白细胞骨架引发铜死亡*
铜离子载体处理导致F-actin减少、G-actin增加，肌动蛋白纤维结构破坏，且MYH9与肌动蛋白共定位形成聚集点。MYH9敲低可逆转上述变化。MYH9与肌动蛋白的结合区域（83-764）删除后，无法破坏细胞骨架和诱发铜死亡。体外实验表明，铜诱导的MYH9聚合物（而非单体）直接抑制G-actin组装为F-actin，而聚合缺陷的MYH92CS无此作用。肌动蛋白聚合抑制剂促进铜死亡，聚合诱导剂jasplakinolide则相反，但均不影响MYH9聚合，证明肌动蛋白位于MYH9下游。
*细胞内铜参与MYH9聚合和铜死亡*
研究人员从化合物库中筛选出HThPA，在无血清条件下以MYH9依赖方式诱导细胞死亡。HThPA增加MYH9的铜结合和聚合，并破坏肌动蛋白细胞骨架，这些效应可被铜螯合剂或MYH9敲除逆转。HThPA不增加细胞内总铜含量，但升高游离铜水平，且其活性不依赖细胞外铜，表明它是一种非铜离子载体型铜死亡诱导剂。在乳腺癌PDX模型和A375异种移植瘤中，HThPA均抑制肿瘤生长并诱导MYH9聚合，且未观察到明显毒性；而ES-Cu则引起体重下降及肝、肾、心肌损伤。HThPA还增强肿瘤内CD8+T细胞浸润和激活，与抗PD-1抗体联用呈现协同抗肿瘤效应。
*GSH下调导致铜释放并诱导MYH9乙酰化*
HThPA处理1小时内降低GSH水平。外源性补充膜通透性GSH乙酯（GSHee）可阻断游离铜释放、MYH9聚合和铜死亡。HThPA同样引起DLAT聚合和线粒体膜破裂，使DLAT释放至胞质乙酰化MYH9，该过程依赖DLAT催化活性。GSH合成抑制剂BSO虽降低GSH，但伴随MT1B等金属硫蛋白的代偿性上调，铜被重新螯合，故不能有效诱导铜死亡。ROS诱导剂处理也不能诱导MYH9聚合，排除了ROS作为主要中介。
*Nur77促进PDK1磷酸化CHAC1以降低GSH水平*
HThPA通过PDK1介导CHAC1磷酸化，从而降解GSH。点击化学探针和质谱鉴定出Nur77为HThPA的直接靶点。X射线晶体结构显示HThPA结合Nur77配体结合域（LBD）的一个疏水口袋，稳定H9-H10环区。HThPA处理后，Nur77作为支架蛋白在胞质中同时结合CHAC1和PDK1，促进CHAC1磷酸化。破坏HThPA与Nur77结合（Nur774mt或Nur77Δ544-551）可消除GSH耗竭、铜释放、MYH9聚合及铜死亡。在Nur77敲除小鼠的原发性肝癌模型和过表达突变体的移植瘤中，HThPA失去抗肿瘤作用。
*细胞内铜依赖性铜死亡在耐药肿瘤中的生理作用*
与亲本细胞相比，7种耐药癌细胞系（对BRAF/MEK抑制剂、紫杉醇、长春新碱、顺铂、乐伐替尼耐药）的总铜水平普遍升高。HThPA在耐药细胞中诱导更强的MYH9聚合和细胞死亡，而铜离子载体DSF-Cu和ES-Cu则在耐药与亲本细胞间无差异。在耐药细胞异种移植瘤中，HThPA更有效地抑制肿瘤生长，并伴随更高的MYH9铜结合和聚合。在Cldn18-ATK小鼠原发性胃癌模型中，HThPA与5-Fu联用几乎完全消除肿瘤；在乐伐替尼耐药Hep-3B移植瘤中，HThPA与乐伐替尼联用进一步增强抗肿瘤效果。临床样本显示，化疗耐药胃癌（8例）和肝癌（8例）患者的肿瘤组织铜含量显著高于化疗敏感患者（15例胃癌、9例肝癌）。从耐药患者分离的原代胃癌细胞中铜水平更高，HThPA诱导的MYH9聚合和铜死亡也更强烈。
**总结与讨论**
该研究确立了MYH9作为铜死亡执行蛋白，其铜依赖性聚合破坏肌动蛋白细胞骨架，构成铜死亡的核心执行事件。与焦亡和坏死性凋亡依赖膜穿孔不同，铜死亡以细胞骨架塌陷为特征。MYH9聚合受到DLAT介导的乙酰化这一翻译后修饰的精细调控，乙酰化中和正电荷，增强铜结合，这使得在生理性低铜浓度下仍能有效启动聚合。HThPA作为一种仅动员细胞内铜的诱导剂，通过Nur77-PDK1-CHAC1轴降解GSH，释放游离铜，避免了铜离子载体带来的全身毒性。由于耐药肿瘤细胞内铜水平普遍升高，HThPA及类似策略可选择性杀伤耐药肿瘤，且与化疗药物联用具有协同效应。细胞内铜水平有望成为筛选铜死亡治疗敏感肿瘤的生物标志物。该研究还为克服肿瘤耐药提供了新的治疗范式。
**研究结论**
本研究表明，MYH9是铜死亡的关键执行蛋白。铜离子载体触发线粒体DLAT释放至胞质，通过乙酰化MYH9增强其铜结合能力，促进MYH9聚合，继而破坏肌动蛋白细胞骨架导致铜死亡。研究还鉴定出HThPA为一种依赖细胞内铜的铜死亡诱导剂，通过靶向Nur77耗竭GSH、增加细胞内游离铜，使乙酰化的MYH9结合铜并发生聚合。由于耐药肿瘤具有更高的铜水平，HThPA通过诱导铜死亡有效克服肿瘤耐药。该研究证明MYH9是铜死亡的执行蛋白，并表明通过细胞内铜诱导铜死亡是治疗耐药肿瘤的一种策略。
