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综述：环状RNA作为RNA稳定性中枢调节因子环状RNA（circular RNAs，circRNAs）是一类通过前体mRNA（pre-mRNA）反向剪接（back-splicing）为主要方式产生的共价闭合单链RNA分子。与线性RNA不同，circRNAs缺乏游离的5′端和3′端，因此天然抵抗外切核糖核酸酶（exoribonuclease）介导的降解，具有极高的内在稳定性。此外，越来越多的证据表明，circRNAs积极参与调控其他RNA种类的稳定性。本综述探讨了决定circRNA稳定性的内在分子特征，并重点阐述了circRNAs通过多种机制与其他RNA种类（包括mRNA和microRNA）交叉调控并影响其稳定性的最新研究进展。最终，我们提供了一个以circRNA为中心的RNA稳定性调控网络的整合性视角。 环状RNA的生物发生与分子功能 环状RNA（circRNAs）是一类独特的转录本，挑战了传统RNA代谢的观点。CircRNAs主要通过一种称为反向剪接的选择性剪接形式产生，即下游的5′-剪接供体位点与上游的3′-剪接受体位点连接，形成共价闭合的环状分子。促进反向剪接事件的主要机制有两种：一是位于环化外显子侧翼内含子中的反向互补序列（在灵长类动物中最常见的是Alu重复元件），通过分子内碱基配对使相关剪接位点靠近，从而触发反向剪接；二是反式作用的RNA结合蛋白（RBPs）结合到环化外显子侧翼的内含子上，RBP的同源或异源二聚化能力促进相关剪接位点的靠近，这种RBP介导的桥接同样触发反向剪接。多种RBPs对circRNA的产生发挥正向或负向调控作用。 CircRNAs可源自细胞核和线粒体中的多种基因组区域。根据基因组来源，circRNAs分为四种类型：外显子circRNAs（ecircRNAs）、外显子-内含子circRNAs（EIciRNAs）、环形内含子RNAs（ciRNAs）以及线粒体编码circRNAs（mecciRNAs）。EcircRNAs最为丰富，由一个或多个反向剪接外显子产生，主要输出至细胞质。许多ecircRNAs富集于神经元和神经突触中，其水平在小鼠和人类的神经组织中随年龄增长而逐渐增加。EIciRNAs通过与U1小核核糖核蛋白相互作用，在细胞核中调控宿主基因转录。许多ciRNAs作为RNA聚合酶II介导转录的正调控因子。MecciRNAs是最近鉴定的一类circRNAs，在线粒体中产生。由于线粒体缺乏类似细胞核的剪接过程，其生物发生不依赖反向剪接，机制尚不清楚。部分mecciRNAs促进蛋白质高效输入线粒体，并调节线粒体活性氧的释放。此外，mecciRNAs与多种人类疾病相关，如心力衰竭、非酒精性脂肪性肝炎和癌症。 除结构独特性外，circRNAs执行多种转录后调控功能。其最经典的角色是作为竞争性内源RNA（ceRNAs）或microRNA（miRNA）海绵。小脑变性相关蛋白1转录本的反义转录本（CDR1as）在人类中携带超过70个miR-7结合位点，在小鼠中为130个，能够有效隔离miR-7，以时空和神经元特异性的方式抑制其活性。另一个circRNA circSRY携带16个miR-138结合位点并隔离该miRNA。CircRNAs还充当蛋白质诱饵和支架。例如，circFOXO3将细胞周期相关蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶2和p21滞留在细胞质中，抑制细胞周期进程。此外，部分circRNAs可以以不依赖帽的方式翻译成功能性肽段。CircZNF609和果蝇circMbl是内源性可翻译circRNAs，产生功能性肽段。真核翻译起始因子4A3（eIF4A3）是反向剪接后沉积到circRNAs上的外显子连接复合物（EJC）的核心组分，直接与真核翻译起始因子3亚基g（eIF3g）相互作用，作为分子桥促进小核糖体亚基的招募，从而在circRNAs上实现翻译的内部起始。除EJC外，RNA修饰、RNA二级或三级结构以及特定核苷酸序列等多种因素均可引导circRNAs上的内部核糖体进入。 circRNAs的内在稳定性 CircRNAs缺乏5′端和3′端，这些内在分子特征使其高度抵抗降解。一项早期研究通过高通量RNA测序分析核糖体RNA去除后经3′-to-5′外切核糖核酸酶RNase R处理的RNA，在转录组水平证明了circRNAs的高度稳定性。该方法特异性富集内源性circRNAs，在人类成纤维细胞中鉴定出超过25000种不同的circRNAs，其中一些circRNAs的丰度比其对应线性前体RNA高10倍。后续大规模转录组分析证实RNase R处理后circRNAs的稳健富集，确立了外切核糖核酸酶抗性作为circRNAs的定义性特征。通过将总RNA分为新合成（4-硫代尿苷标记）和预先存在部分，并利用动力学算法计算RNA半衰期，分析了60种circRNAs及其线性前体RNA的稳定性。CircRNAs的半衰期为18.8至23.7小时，而其线性前体对应物为4.0至7.4小时。CircRNAs相对于其线性前体更高的稳定性也在果蝇头部跨成年整个寿命期六个时间点的circRNA谱分析中得到体内验证，结果显示总circRNA读数随年龄线性增加。这些开创性研究确立了共价环状拓扑结构足以保护circRNAs免受外切核糖核酸酶攻击。 诱导circRNA降解的分子特征 尽管circRNAs具有内在拓扑稳定性，它们仍受多种降解途径调控。部分circRNAs经历Argonaute 2（AGO2）依赖的内切核糖核酸酶切割。例如，CDR1as含有一个与miR-671近乎完全互补的结合位点，这种近完全碱基配对驱动AGO2介导的circRNA内切核糖核酸酶切割。miR-7与海绵位点之间的不完全互补不足以激活AGO2介导的circRNA降解。近完全与不完全互补之间的机制差异可能解释单个circRNA如何同时作为miRNA海绵或AGO2介导降解的底物。 GW182是miRNA介导基因沉默的关键因子，也能以不依赖miRNA的方式触发circRNAs的快速降解。在果蝇DL1细胞中，内源性circRNAs的半衰期显著长于其对应线性mRNA。小干扰RNA（siRNA）介导的GW182敲低显著延长circRNAs半衰期，而GW182过表达则产生相反效果。GW182的三个人类同源物TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C在HeLa细胞中被验证具有相当的circRNA降解能力。GW182介导circRNA降解的进化保守性及其对miRNA的独立性提示circRNA稳定性的新调控层和机制独特性。 RNA修饰也促进circRNAs的快速降解。N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA最丰富的内部修饰。CircRNAs中的m6A影响circRNAs的所有分子层面，包括生物发生、核质输出、翻译内部起始和稳定性。CircRNAs内的m6A位点作为m6A阅读蛋白YTH结构域家族成员2（YTHDF2）的结合平台。YTHDF2直接与适配器RBP热响应蛋白12（HRSP12）相互作用，后者招募内切核糖核酸酶RNase P/MRP复合物，从而触发含m6A circRNAs的快速降解。值得注意的是，m6A与另一种RNA修饰N1-甲基腺苷（m1A）协同促进circRNAs降解。 RNA二级或三级结构也影响circRNA稳定性。circRNAs中存在的高度结构化区域被GAP SH3结构域结合蛋白1（G3BP1）选择性识别，G3BP1招募RNA解旋酶Up-frameshift 1（UPF1）。UPF1解开circRNAs内的结构，促进其快速降解，此过程称为结构介导的RNA衰变（SRD）。 在某些情况下，circRNAs被内切核糖核酸酶直接识别和降解。DIS3是含PIN结构域的内切核糖核酸酶，也是RNA外切体的催化亚基。DIS3优先识别circRNAs中的U-rich序列并触发细胞质中大多数circRNAs的快速降解。circRNA降解依赖DIS3的PIN内切核糖核酸酶结构域而非其3′-to-5′外切核糖核酸酶活性。内切核糖核酸酶RNASEK与热休克蛋白90（HSP90）协同促进部分circRNAs的降解。RNASEK表达的年龄依赖性下降导致circRNAs渐进性积累、应激颗粒功能障碍以及线虫和哺乳动物的加速衰老表型。RNASEK和溶酶体内切核糖核酸酶RNASE1分别在溶酶体外和内部降解circRNAs，参与应激反应保护。MecciRNAs被ELAC核糖核酸酶Z2（ELAC2）与ATP依赖性RNA解旋酶SUPV3L1复合物快速降解，影响线粒体功能。 部分可翻译circRNAs可通过与线性mRNA上经典mRNA监视机制——无义介导的mRNA降解（NMD）相似的机制被降解。经典NMD依赖翻译事件和EJC。反向剪接产生的circRNAs在反向剪接连接点（BSJ）上游20–24核苷酸处携带EJC。当这些circRNAs进行不依赖帽的翻译时，终止密码子位于EJC足够上游处触发NMD，称为NMD样circRNA降解（NCD）。NCD与经典NMD均依赖翻译事件和位于翻译终止密码子下游的EJC，但二者在NMD因子需求上存在差异：经典NMD使用多种降解途径，而NCD仅使用内切核糖核酸酶切割；经典NMD与帽依赖性翻译偶联，而NCD需要circRNAs上的内部核糖体进入。 病毒感染影响circRNA稳定性。正常条件下，细胞circRNAs倾向于形成16–26碱基对的不完美分子内RNA双链体，结合并抑制双链RNA激活蛋白激酶（PKR），防止PKR介导的全局翻译停滞。然而，病毒感染或poly(I:C)处理触发2′–5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）–RNASEL通路，导致1–2小时内80–90%细胞circRNAs的内切核糖核酸酶降解。这种快速降解解除PKR抑制并促进抗病毒激活。 上述circRNA降解途径主要发生在细胞质中，但部分circRNAs在细胞核中被降解。ci-ankrd52在其基因组起源位点形成R-loop结构，在RNA:DNA杂交体中，ci-ankrd52被内切核糖核酸酶RNASEH1切割。 circRNA介导的RNA稳定化 CircRNAs通过多种直接和间接途径与其他RNA种类交叉调控以增强其稳定性。最典型的例子是通过miRNA海绵作用实现mRNA稳定化。通过隔离miRNA，circRNAs间接稳定原本会快速降解的靶mRNA。 CircRNAs还参与miRNA稳定化。靶向miRNA降解（TDMD）导致miRNA本身的降解。CircRNA Cdr1as对保护miR-7免受长链非编码RNA Cyrano诱导的TDMD至关重要。虽然内源性环状Cdr1as隔离miR-7并保护其免受降解，但人工线性化的相同序列反而触发miR-7的TDMD。这表明Cdr1as的环状拓扑结构是保护miR-7免受TDMD所必需的。 部分circRNAs通过直接分子间碱基配对与mRNA交叉调控以稳定mRNA。CircMAN1A2异构体通过其BSJ序列直接结合着丝粒蛋白B（CENPB）mRNA的3′-非翻译区（3′ UTR），以胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）依赖的方式增加CENPB mRNA稳定性。CircARID1A直接结合溶质载体家族7成员5（SLC7A5）mRNA，形成circARID1A–IGF2BP3–SLC7A5三元复合物以稳定SLC7A5 mRNA。CircZNF609的BSJ重叠约30个核苷酸与细胞骨架相关蛋白5（CKAP5）mRNA的3′ UTR碱基配对，招募ELAV样RNA结合蛋白1（ELAVL1）以保护CKAP5 mRNA免于降解。CircFOXK2通过直接RNA-RNA碱基配对稳定细胞周期蛋白D1（CCND1）mRNA并随后招募ELAVL1，促进细胞周期进程和雌激素受体阳性乳腺癌的内分泌治疗耐药。 RBPs通常通过circRNAs交叉调控参与mRNA稳定化。ELAVL1优先结合mRNA 3′ UTR中的AU-rich元件并保护其免于去腺苷酸化。CircMyc直接与ELAVL1结合，将ELAVL1重新定位到固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）mRNA上并增加其半衰期。Circ-CCND1使用双重机制稳定CCND1 mRNA，既作为ELAVL1结合的支架又作为miR-646的海绵。IGF2BPs家族也参与circRNAs交叉调控的mRNA稳定化。CircXPO1增强IGF2BP1介导的连环蛋白β1（CTNNB1）mRNA稳定化。CircITGB6通过直接与IGF2BP3相互作用稳定podoplanin（PDPN）mRNA。CircNSUN2与IGF2BP2和高迁移率族AT-hook 2（HMGA2）mRNA形成三元复合物，稳定HMGA2 mRNA。CircNFATC3通过阻止三重基序蛋白25（TRIM25）介导的IGF2BP3泛素化，保护其免受蛋白酶体降解，从而增加CCND1 mRNA的半衰期。 RNA修饰通常与circRNA介导的mRNA稳定化相关。IGF2BPs识别靶mRNA上的m6A修饰并组装包含ELAVL1、matrin 3（MATR3）和poly(A)结合蛋白细胞质1（PABPC1）的稳定复合物。CircRARS与IGF2BP3、ELAVL1、MATR3和PABPC1形成复合物并稳定含m6A的mRNAs。CircRNF13以m6A依赖方式促进IGF2BP1的液-液相分离（LLPS），驱动优先稳定整合素亚基β1（ITGB1）mRNA的凝聚体形成。 circRNA介导的RNA去稳定化 CircRNAs可通过直接分子间碱基配对或RBP介导的相互作用引发其他RNA种类的快速降解。与circRNA介导的TDMD阻断相反，一些人工circRNAs能以环状拓扑依赖方式诱导miRNAs的TDMD。 CircRNA-mRNA碱基配对也能导致mRNAs的快速降解，这由circRNA诱导的无义介导的mRNA降解（circNMD）所凸显。当circRNA通过直接碱基配对结合mRNA的3′ UTR时，反向剪接期间沉积在circRNA上的EJC能与终止核糖体以反式方式通信，从而诱导靶mRNA的NMD。CircNMD与经典NMD共享多种分子特征，需要所有经典NMD因子和核心EJC组分，并依赖mRNA翻译。但circNMD有两个独特分子特征：第一，反义寡核苷酸（ASOs）处理破坏circRNA-mRNA碱基配对可完全消除circNMD；第二，经典NMD底物需要核剪接将EJC沉积到mRNA的3′ UTR，而circNMD底物利用circRNAs BSJ处已有的EJC绕过此要求，因此无内含子mRNAs也可成为circNMD靶标。 CircRNAs可通过与特定RBPs相互作用触发mRNAs快速降解。CircDLC1与基质金属蛋白酶1（MMP1）mRNA竞争结合ELAVL1，导致肝细胞癌细胞中MMP1 mRNA快速降解。CircBtnl1与激活转录因子4（Atf4）mRNA竞争结合DEAD-box解旋酶3，Y连锁（Ddx3y），从而 destabilize 小鼠肠干细胞中的Atf4 mRNA。Circ-TNPO3直接结合IGF2BP2，触发丝氨酸蛋白酶抑制剂H家族成员1（SERPINH1）mRNA的快速降解。CircRHOBTB3促进ELAVL1的泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制ELAVL1介导的多嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）mRNA稳定化。 结论与展望 CircRNAs通过多种分子机制调控其他RNA种类的稳定性，包括直接分子间RNA-RNA碱基配对以及特定RBPs或其他RNAs的招募、隔离和空间重分布。除稳定性外，circRNAs参与基因调控通路的所有层面，包括转录、RNA输出和mRNA翻译。纳米孔长读长测序结合circRNA富集的最新进展揭示了circRNA多样性的显著规模，在人类中鉴定出超过180万个全长circRNA异构体，在小鼠中约135000个全长异构体。鉴于这些机制复杂性和内源性circRNAs的庞大库容，circRNAs可能比目前认识到的更广泛地影响基因调控网络，使其成为控制基因表达机制的中枢协调者。 CircRNAs的内在稳定性为治疗应用提供了有前景的机会。针对SARS-CoV-2的circRNA疫苗显示出比N1-甲基假尿苷修饰的线性对应物更优越和更持久的抗原产生，在小鼠和猴子中引发强效体液和细胞免疫应答。小circRNA新抗原疫苗增强小鼠CD8+ T细胞应答并减少免疫抑制，从而抑制肿瘤生长。人工设计的circRNAs只要正确设计以结合靶mRNA的3′ UTR，即可重现并诱导靶mRNA的circNMD，表明circRNAs可作为基因沉默工具，类似于miRNA或siRNA介导的基因沉默。鉴于circRNAs相比线性对应物以及miRNAs和siRNAs具有更优越的稳定性，基于circNMD的基因沉默可能为circRNA生物学和RNA治疗开辟新途径。 |
