翻译（translation）是基因表达的核心过程。其调控复杂，依赖于细胞状态和亚细胞环境等因素，并受到与转录（transcription）或转位（translocation）等过程发生交叉对话（crosstalk）的调节。在本研究中，研究人员利用冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）对天然及抗生素扰动的肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）细胞进行成像，解析了140个结构图谱，重现了细菌翻译在起始（initiation）、延伸（elongation）和再循环（recycling）阶段的进行过程。研究人员观察到了多种转录-翻译复合物（transcription-translation complexes, T-TCs），由此提出了一种基于穿线（threading）方式的翻译重新起始机制，并为长期假设的、可协调转录、翻译和膜附着的超复合物提供了结构证据。研究人员解析了大量膜相关的大核糖体亚基，并表明其从膜上解离取决于新翻译的条件性起始，这与哺乳动物细胞中可能保守的机制一致。这项工作可视化了细菌翻译的多层调控，并展示了细胞内结构生物学（in-cell structural biology）在研究基因表达调控回路中的强大能力。
翻译是基因表达中的核心过程，其调控受到细胞状态、亚细胞环境以及与转录或蛋白转位等过程交叉对话的多层次影响。尽管体外研究已对原核翻译的许多步骤有了深入刻画，但翻译各阶段间的调控网络，尤其是起始阶段因子结合顺序、转录-翻译耦合以及核糖体在膜上的动态调控仍不清楚。肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是基因组高度缩减的最小细菌，生长缓慢，蛋白质合成机器浓度低，适合作为原位结构生物学研究的模式生物。研究人员利用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）对254个天然细胞以及抗生素扰动细胞进行了全细胞高分辨率成像，通过穷举定位和分类，系统解析并量化了30S、50S和70S核糖体复合物在翻译起始、延伸、再循环阶段的分布及与转录、膜转位等过程的偶联关系。共解析140个结构图谱，提出起始终因子有序结合模型，证实延伸期转录-翻译复合物的碰撞在正常生长条件下普遍存在，并提供了转录-翻译-膜附着超复合物的直接结构证据。研究还发现膜结合50S大亚基的释放受翻译重新起始的条件性调控，且该机制在人类细胞中可能保守。该工作展示了细胞内结构生物学在揭示基因表达调控回路中的强大威力，为系统级理解翻译调控提供了全新视角。论文发表在《Cell》。
为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：对M. pneumoniae M129-B7（ATCC 29342）天然细胞（n=254）及经伪尿苷霉素（PUM，n=124）、非达霉素（FID，n=100）、氯霉素（Cm，n=121）处理的细胞进行冷冻固定和倾斜系列采集；用模板匹配与DeePiCt深度学习模型进行颗粒挑选，反复进行亚断层图分类、精修和m-correction；利用RELION和M软件进行共识精修和多轮分类以分辨不同翻译状态；使用AlphaFold3预测分子模型并刚性拟合到中等分辨率图谱；此外还重分析了人类ER微体数据集（EMPIAR：11751）和E. coli冷冻薄片样品作为对照。
结果部分如下。
翻译复合物与细胞体积的协调。通过对254个天然细胞中29,654个游离30S、27,655个游离50S和51,496个70S核糖体进行定位和计数，发现核糖核蛋白颗粒（RNP）总数随细胞体积线性增加，但浓度呈双曲线下降；70S与游离亚基比值随体积线性增加，单体比例下降而多聚体比例上升，提示较大细胞具有更高翻译活性。
沿着翻译周期可视化和量化复合物。通过大规模结构亚分类，解析并量化了起始阶段8种、延伸阶段14种、再循环阶段4种复合物。其中A/P态70S是最常见核糖体种类（中位12.3%），还发现多个EOUT tRNA退出中间态。再循环方面，解析了50S-RRF-EF-G、50S-RRF及无因子50S，提示降解因子顺序解离。较小细胞（体积底部25%）富集再循环相关复合物，而较大细胞则富集起始和延伸相关状态，表明翻译调控程序在细胞分裂与生长间发生转变。
起始通过优先的因子关联顺序进行。通过解析多种30S起始复合物并结合UMAP单细胞聚类，提出M. pneumoniae中起始因子的结合具有偏好顺序：30S先结合IF3，随后IF1，然后可能先结合tRNA或IF2，最终形成30S IF1/2/3/tRNA。IF2通常在起始tRNA之后结合。其中30S IF1/3 tRNA复合物占30S的41%，可能是重要检查点。
延伸的转录-翻译复合物在天然细胞中偶联和碰撞。在正常生长的细胞中解析出稳定、柔性和碰撞三种延伸态转录-翻译复合物（eT-TC），分别占70S的6.3%、9%和5%，其中碰撞态占所有eT-TC的25%。碰撞复合物中NusA桥接被排除，RNAP重新定位到mRNA入口上方。碰撞复合物中核糖体的tRNA和EF状态分布与稳定态不同，提示碰撞时翻译延伸减慢但不终止，可能是解决RNAP临时停顿的功能性装配。
转录和翻译在起始过程中物理连接。解析了起始态转录-翻译复合物（iT-TC）的稳定和柔性形式，共占30S复合物的30%。PUM处理使iT-TC比例增至69%，FID处理则减少至22%且稳定iT-TC缺失DNA和NusG密度，表明iT-TC在转录终止后仍可维持。
转录-翻译连接提示基于穿线的重新起始机制。由于iT-TC中RNAP的RNA出口位于30S mRNA入口正上方，且FID处理后稳定iT-TC相对比例上升，研究人员提出eT-TC终止后RNAP可能直接将mRNA“穿线”入耦合的30S，实现无需解离的翻译重新起始。这可能补偿M. pneumoniae中SD序列稀少和bS1缺失带来的起始效率不足。
细胞膜上的翻译调控。发现膜结合70S复合物（每细胞7.5个）以及转录-翻译-膜附着同时发生的“transertion样”超复合物（每细胞2个，RNAP有稳定、柔性、碰撞三种构象），为长期假设的这种协调复合物提供了直接结构证据。膜结合区密度主要由SecDF解释，但未解析到明确的SecYEG，提示M. pneumoniae可能具有不同于E. coli的共翻译转位组织方式。
大亚基在翻译终止后保持膜锚定。膜结合50S（每细胞11个）数量超过膜结合70S，且在小细胞中比例更高。Cm和PUM处理增加膜结合70S并减少膜结合50S，而FID处理在基因表达完成后使膜结合70S锐减并显著积累膜结合50S。结合人ER微体数据中60S与SEC61转位复合物结合的现象，支持一种保守模型：大亚基在终止后保持膜锚定，仅当新一轮翻译起始被条件性激活时才从膜上解离。
综合讨论与结论，该研究通过细胞内cryo-ET完整描绘了细菌翻译周期各阶段复合物的结构和丰度，阐明了起始因子有序结合、延伸期转录-翻译碰撞的生理意义、穿线式重新起始机制以及膜附着调控的保守原理。研究结论指出：该工作结合细胞特征与结构分析，揭示了调节翻译周期的调控相互作用；单细胞分析与计算分类的结合提供了对翻译起始结构动力学的定量理解；对转录-翻译耦合的研究解决了碰撞在正常生长条件下是否具有生理相关性的问题；量化了起始期间转录-翻译耦合的程度，并提出了其在重新起始中的意外作用；膜相关核糖体分析直观展示了连接转录、翻译和膜附着的超复合物，并提示核糖体膜附着调控原理可能从最小细菌保守至人类细胞。研究也承认技术局限，例如较大细胞不完全成像、分类统计误差、中等分辨率模型拟合的不确定性以及瞬时中间体的可能缺失，未来仍需进一步解析机制细节。
