绵羊呼吸道病原体与不同生产阶段死亡率的分阶段关联：基于多变量分析的研究

绵羊呼吸道复合体（Ovine Respiratory Complex，ORC）是集约化和半集约化绵羊生产系统中羔羊死亡的主要原因。其多因素病因涉及细菌和病毒病原体以及宿主和环境因素，使疾病控制复杂化，并限制了常规预防措施的有效性。尽管呼吸道病原体在健康羔羊中常被检出，但其在不同生产阶段对死亡率的贡献仍知之甚少。本研究采用典型多变量分析评估了呼吸道病原体与羔羊死亡率之间的关系。研究共采集了西班牙西南部10个商业化绵羊养殖场中200份来自表观健康、日龄为50–60天羔羊的支气管肺泡灌洗液样本，采样时间分别为冬季（n = 80）和夏季（n = 120）。样本通过实时PCR检测主要细菌和病毒性呼吸道病原体，并将2022–2023年养殖场和育肥场的死亡率记录纳入分析。在畜群水平上，多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、海藻糖比伯斯坦菌（Bibersteinia trehalosi）和绵羊肺炎支原体（Mesomycoplasma ovipneumoniae）检出率较高，而睡眠嗜组织菌（Histophilus somni）、羊传染性脓疱病毒（Orf virus）和副流感病毒3型（parainfluenza virus type 3，PIV3）检出率居中。病原体流行率未观察到显著的季节性差异。ORC相关病原体约占死亡率方差的20%，提示非感染性因素在羔羊损失中也发挥重要作用。典型分析识别出阶段特异性的多变量模式，其中绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）对以养殖场死亡率为特征的典型维度贡献最大，而溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）与多杀性巴氏杆菌（P. multocida）及副流感病毒3型（PIV3）对以育肥场死亡率为特征的维度贡献最大。这些发现加深了研究人员对ORC流行病学的理解，并支持制定针对性的监测、预防措施、针对养殖场内流行血清型的母羊有效疫苗接种以及管理策略，以降低羔羊死亡率、改善动物福利并提升绵羊生产的可持续性。

一、研究背景与目的

绵羊肉类生产是伊比利亚半岛西南部的重要经济活动，通常采用粗放或半集约化生产体系。羔羊断奶后通常被转运至育肥场进行约21天的育肥，随后在当地屠宰场屠宰。在这一阶段，动物易患多种疾病，其中呼吸道疾病是导致高发病率和高死亡率、增重减少以及屠宰时胴体废弃的重要原因。绵羊呼吸道复合体（Ovine Respiratory Complex，ORC）是一种多因素综合征，由感染性病原体、宿主以及环境和管理因素之间的复杂相互作用共同导致，这使得有效的预防和控制变得十分困难。在育肥阶段，ORC的发病率和死亡率可分别高达75%和50%。多种应激因素，包括断奶后日粮变化、运输至育肥场、不同来源羔羊的混群、过度拥挤以及不利的环境条件，都可能加剧ORC，尤其是在混合感染存在的情况下。

巴斯德菌科（Pasteurellaceae）成员，尤其是多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）和海藻糖比伯斯坦菌（Bibersteinia trehalosi），一直被认定为主要与ORC相关的细菌病原体。这些细菌通常作为上呼吸道的共生菌存在，但在应激或免疫抑制条件下可能转变为致病状态。绵羊肺炎支原体（Mesomycoplasma ovipneumoniae）也被确定为主要病原体，可能使动物易发生涉及巴斯德菌科的继发感染。其他微生物如睡眠嗜组织菌（Histophilus somni）以及病毒性病原体如副流感病毒3型（parainfluenza virus type 3，PIV3）和羊传染性脓疱病毒（Orf virus）也可能加剧疾病严重程度。

尽管已有研究描述了ORC相关微生物的流行率和致病作用，但很少有研究定量评估其在不同生产阶段与死亡率的联合关联。尤其是表观健康羔羊中病原体检出与后续阶段特异性死亡率之间的关系仍知之甚少。因此，本研究旨在量化并模拟ORC相关病原体与养殖场和育肥场不同生产阶段死亡率之间的多变量关系，以识别与死亡风险相关的阶段特异性模式。

二、研究设计与方法

本研究在西班牙西南部一个具有大陆性地中海气候的地区开展，涉及10个绵羊肉类生产养殖场。2023年2月至9月期间，共采集了200份来自表观健康、日龄50–60天羔羊的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）样本，其中冬季（2月至4月）每场采集8份样本（共80份），夏季（6月至9月）每场采集12份样本（共120份）。死亡率数据来源于2022至2023年养殖场或育肥场的记录。

研究人员采用的主要技术方法包括：实时PCR检测七种主要呼吸道病原体；正则化典型相关分析（Regularized Canonical Correlation Analysis，RCCA）评估病原体与死亡率两组变量之间的多变量线性关系；多元方差分析（MANOVA）作为补充的多变量推断框架；组群置换检验（herd-block permutation）用于统计推断；10折交叉验证确定正则化参数；组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）评估畜群内聚集结构；以及畜群水平敏感性分析检验结果的稳健性。

三、主要研究结果

3.1 前提假设检验

研究人员对RCCA的前提假设进行了评估。Shapiro-Wilk检验提示偏离正态性，但D'Agostino-Pearson检验显示无显著偏离。Levene检验表明方差不齐性显著，为此采用置换检验进行推断。ROUT方法未发现离群值，方差膨胀因子（VIF）均低于阈值5，样本量满足要求。

3.2 畜群内层级结构评估

七种病原体的组内相关系数（ICC）范围为0.129至0.363，其中溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）最低，绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）最高。设计效应范围为3.442至7.899，对应有效样本量为58.1至25.3个观测值，表明畜群内聚集可能显著降低独立信息量。

3.3 畜群水平敏感性分析

在畜群水平上，绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）平均Cq值与养殖场死亡率呈负相关（r = ?0.466），与个体水平分析方向一致。溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）平均Cq值与育肥场死亡率呈显著正相关（r = 0.839，p = 0.002），多杀性巴氏杆菌（P. multocida）和PIV3也呈正相关，方向与个体水平分析一致。

3.4 描述性分析

个体水平上，溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）和绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）检出率最高，分别为91.5%和73.5%；海藻糖比伯斯坦菌（B. trehalosi）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）约为30.5%；睡眠嗜组织菌（H. somni）、Orf病毒和PIV3检出率较低，均为10%左右。畜群水平上，多杀性巴氏杆菌（P. multocida）、溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）、海藻糖比伯斯坦菌（B. trehalosi）和绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）检出率为90–100%。最常见的病原体组合为溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）加绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae），检出率为27.0%。仅2只羔羊（1%）对所有病原体均为阴性。

3.5 正则化典型相关分析（RCCA）

皮尔逊相关分析显示，绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）与溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）（r = 0.5120）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）（r = 0.5272）呈强正相关。养殖场死亡率与绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）Cq值呈中等负相关（r = ?0.2955），育肥场死亡率与溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）（r = 0.3226）、多杀性巴氏杆菌（P. multocida）（r = 0.2667）和PIV3（r = 0.2122）的Cq值呈正相关。

全局MANOVA的四种多变量准则均显示p < 0.0001，表明在羔羊观测水平上存在统计学可检测的多变量结构。RCCA识别出两个典型维度，典型相关系数分别为0.4832和0.4192，对应23.35%和17.57%的共享方差。然而，组群置换检验显示所有全局统计量的经验p值均大于0.05，表明在考虑畜群层级结构后，多变量关联未达到统计学显著水平。

第一典型维度（F1）被解释为慢性定植与养殖场死亡率轴，绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）（载荷0.7754）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）（载荷0.3732）呈正载荷，而养殖场死亡率呈强负载荷（?0.8841）。第二典型维度（F2）被解释为急性育肥场相关死亡率轴，育肥场死亡率（载荷0.9808）和溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）（载荷0.7422）呈强正载荷，多杀性巴氏杆菌（P. multocida）（0.5633）和PIV3（0.5582）也呈中等正载荷。冗余系数显示，死亡率变量集的总冗余约为19.94%，表明大多数死亡率变量的变异性未被典型关系所解释。

四、讨论与结论

讨论部分指出，绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）与养殖场死亡率关联最密切，可能作为原发性病原体损伤上呼吸道并促使早期病理发展。绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）可损害黏液纤毛清除功能并诱导慢性上皮炎症，促进继发细菌定植。在育肥场阶段，溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）在第二典型维度中病原体侧载荷最强，与既往关于其在应激条件下引起育肥羔羊急性呼吸道疾病和死亡的报道一致。研究还指出，Cq值与死亡率之间的正相关并不表示较高死亡率与更大病原体分子载量相关，而是与较低分子信号相关，这可能反映了样本来自表观健康羔羊以及分子检出不一定表示活动性疾病。

研究结论为：绵羊呼吸道复合体内病原体与死亡率的关系因生产阶段而异。绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）和多杀性巴氏杆菌（P. multocida）在第一典型维度中与养殖场死亡率呈对立关系，而溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica）与多杀性巴氏杆菌（P. multocida）和PIV3共同对以育肥场死亡率为主要特征的第二典型维度贡献最大。然而，组群置换分析未提供显著的全局经验p值，这些典型模式应被解释为多变量结构的描述性成分而非病原体对死亡率的独立效应证据。典型结构显示冗余有限，死亡率变量集的总冗余约为19.94%，表明大多数原始死亡率变量的变异性未被典型关系所捕获。未来需要将分子病原体监测与临床、病理、环境和管理数据相结合的研究，以及预防干预措施的评估，以阐明这些多因素关系及其与死亡率的相关性，从而改善动物福利并减少绵羊生产中的死亡损失。