## 摘要
骨肉瘤是青少年和年轻成人中最常见的原发性骨恶性肿瘤，其长期生存率仍然较差，死亡率很高。尽管免疫检查点阻断（ICB）已改变了多种癌症的治疗方式，但其在骨肉瘤中的益处微乎其微，这主要归因于骨肉瘤的"免疫冷"表型，即肿瘤浸润性淋巴细胞稀少。迫切需要开发新的策略来克服这种抵抗。Y-box结合蛋白1（YB-1）是冷休克蛋白超家族的一个促癌成员，代表着使骨肉瘤对ICB敏感的有前景的治疗靶点。在本研究中，我们评估了SU056——一种小分子YB-1抑制剂，它既能抑制骨肉瘤自身的肿瘤生长，又能重塑肿瘤微环境。SU056处理显著减少了免疫抑制性细胞群体，包括调节性T细胞和M2极化的肿瘤相关巨噬细胞，同时增强了含颗粒酶B的细胞毒性CD8? T细胞和NK细胞的浸润。SU056与抗PD-1阻断剂的联合治疗在抑制肿瘤生长和延长生存时间方面均优于单药治疗。这些发现突出了SU056作为一种强效免疫调节剂的作用，并支持其与ICB联合用药作为骨肉瘤的有前景的治疗方案。
## 引言
骨肉瘤是青少年和年轻成人中最常见的原发性骨肿瘤。尽管过去30年付出了巨大努力，但骨肉瘤的治疗结果几乎没有改善（1, 2）。标准治疗通常包括术前化疗、手术及辅助化疗，生存率约为65%（3）。然而，30%至50%的患者将发生转移性复发（4, 5），该群体的生存率仅为12%（6–8）。因此，需要新的治疗或新颖的联合疗法来改善骨肉瘤的治疗效果。免疫检查点阻断（ICB）治疗，如抗PD-1和抗PD-L1，已改变了多种实体瘤的治疗（9）；然而，其在骨肉瘤中的疗效有限（10–12）。ICB应答的一个预测性生物标志物是肿瘤突变负荷（TMB），即肿瘤DNA中遗传突变数量的度量，可以反映肿瘤来源的免疫原性新抗原的潜在能力。不幸的是，与其他肿瘤类型相比，骨肉瘤的TMB较低，尽管TMB较高的骨肉瘤患者总体生存率有所改善，这可能提示了抗肿瘤免疫反应的潜力（13）。骨肉瘤通常较低的TMB对应于其较差的免疫原性（13），这反映在肿瘤浸润性免疫细胞数量较少上，形成了由免疫抑制性肿瘤微环境（TME）主导的"冷"肿瘤表型。骨肉瘤肿瘤被多种促进免疫抑制的细胞浸润，如调节性T细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和髓源性抑制细胞（MDSC）。因此，通过新型组合疗法靶向TME以逆转免疫抑制，可能克服耐药性并增强ICB疗效。Y-box结合蛋白1（YB-1，YBX1）是公认的促癌因子，也是高度保守的冷休克蛋白超家族成员。通过其RNA结合域，YB-1协调广泛的转录后和转录调控机制，涵盖mRNA转录、DNA损伤反应和修复、RNA剪接、转录本稳定以及生理和病理状态下的翻译调控（14–16）。YB-1充当多种促转移应激反应因子的翻译激活剂，在多种人类恶性肿瘤中发挥促转移功能。例如，在乳腺癌中，YB-1通过增强关键转录因子的翻译——包括SNAIL、TWIST和ZEB2——从而促进上皮-间质转化（EMT）的进展和转移性扩散（17）。在结直肠癌中，YB-1通过翻译上调IGF1受体来促进肝转移（18）。在乳腺癌和肝细胞癌中，YB-1同时激活PD-L1和PD-1的表达，通过限制抗肿瘤免疫反应来促进癌细胞增殖和转移（19, 20）。这表明YB-1可以促进免疫抑制性TME。在肉瘤中，YB-1通过直接结合HIF1A mRNA的5′非翻译区，增强其翻译并提高HIF-1α蛋白合成，从而在缺氧条件下促进转移潜能（21）。YB-1在骨肉瘤中高表达，且与不良预后密切相关（21, 22）。事实上，在骨肉瘤中敲低YB-1诱导了细胞周期阻滞，并在体外和体内抑制了肿瘤细胞生长（22），该结果部分归因于CD8? T细胞（19），表明YB-1可能是骨肉瘤中一个强效的分子靶点，既能直接抑制骨肉瘤生长，又能改变免疫抑制性TME。在先前研究中，我们描述了SU056——一种鬼臼毒素的氟化衍生物的合成。我们通过下拉实验和表面等离子体共振证明SU056直接与YB-1相互作用（23, 24），并在卵巢癌和三阴性乳腺癌（TNBC）模型中作为YB-1活性的强效抑制剂发挥作用，SU056抑制肿瘤进展，增强化疗药物的疗效，并调节关键的促癌翻译通路（23, 24）。SU056是否有效抑制骨肉瘤中的YB-1并改变TME仍是一个悬而未决的问题。在此，我们假设SU056对YB-1的抑制将直接抑制骨肉瘤肿瘤生长，这与我们先前在卵巢癌和TNBC中的观察一致（23, 24）。我们进一步推测，SU056介导的YB-1耗竭及其导致的肿瘤细胞死亡将重塑TME，从而增强骨肉瘤对ICB的敏感性。我们的研究结果表明，SU056是骨肉瘤进展的强效抑制剂，在体外和体内均如此。重要的是，SU056处理增加了骨肉瘤肿瘤的总体免疫浸润，同时减少了免疫抑制性TAM的浸润，将TME转变为更具活性的抗肿瘤状态。综上所述，这些结果支持SU056作为一种有前景的靶向小分子疗法，并突显了其扩展骨肉瘤患者免疫疗法疗效的潜力。
## 材料与方法
### 细胞系
人骨肉瘤细胞系143B（雌性；RRID: CVCL_2270）、OS17（RRID: CVCL_Z613）、SaOS（雌性；RRID: CVCL_1E51）和U2OS（雌性；RRID: CVCL_0042）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。小鼠骨肉瘤同基因细胞系K7M2（RRID: CVCL_V455）购自ATCC。mOS13和mOS69小鼠同基因细胞系按照先前描述的方法生成（25），由Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori的Claudia Chiodoni博士慷慨提供。小鼠骨肉瘤细胞系U61236和U61323是通过从Osx1-Cre、Trp53?/?、Rb1?/?基因工程小鼠产生的肿瘤中分离获得的，方法如先前所述（26）。患者来源的异种移植瘤（PDX），295-R和323-R，获得自美国国立癌症研究所的患者来源模型库。乱序对照（SC）和YBX1敲低短发夹RNA（shRNA；YBX1-shRNA1和YBX1-shRNA2）细胞系是通过基于慢病毒的转导构建的，并使用嘌呤霉素抗性进行筛选。细胞系传代不超过10至12代。所有细胞系持续监测倍增时间，并通过显微镜观察污染情况（如真菌或酵母）和形态学评估。未对细胞库细胞系进行支原体检测和鉴定或再鉴定。所有细胞系均在DMEM或RPMI 1640培养基中培养，补充10% FBS（Corning，#35-015-CV）和1%青霉素/链霉素，于37°C、5% CO?湿化培养箱中培养。
### SU056的合成
SU056的合成和表征如Tailor等人先前报道的方法（24）。
### 细胞活力测定
每孔接种2,000至3,000个细胞于96孔培养板中。24小时后，用指定浓度的SU056处理细胞48小时，然后用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）显色。具体而言，将0.5 mg/mL溶于1× PBS的MTT加入每个孔中，使其形成甲臜结晶。去除MTT后，用DMSO溶解结晶，然后使用Tecan多模式读板仪在570 nm处读数。
### 集落形成实验
每孔接种5,000个细胞于12孔培养板中。24小时后，用指定浓度的SU056处理细胞7至10天。用结晶紫染色集落，并使用Tecan多模式读板仪扫描融合度。
### 球体形成
将K7M2细胞以每孔100个细胞的密度接种于超低附着24孔板中，使用补充了hEGF、胰岛素、氢化可的松BPE和2-巯基乙醇的MEGM培养基（Lonza，#CC-3150）。24小时后，用指定浓度的SU056处理细胞约7至10天。在显微镜下计数球体数量。
### 细胞周期分析
每孔接种50,000个细胞。24小时后，用指定浓度的SU056处理细胞24小时。通过胰蛋白酶消化收集活细胞和死细胞，细胞沉淀用70%乙醇固定。用碘化丙啶（PI）混合液（80 μg/mL RNase A，50 μg/mL PI溶于皂苷-EDTA溶液中）染色固定细胞，在4°C过夜孵育。使用LSRFortessa流式细胞仪（Becton Dickinson）分析样品，并使用FACSDiva软件计算各细胞周期阶段的细胞百分比。
### 联合指数计算
多柔比星和SU056的联合指数（CI）使用Chou-Talalay方法计算（27）。CI值通过CompuSyn软件计算。CI <1、CI = 1和CI >1分别表示组合的协同效应、相加效应和拮抗效应。
### Seahorse XFe96检测
使用Seahorse XFe96分析仪（Agilent）评估糖酵解速率。U2OS细胞以3 × 103的密度接种，随后用2.5至5 μmol/L SU056处理6或24小时。检测前一天，将96孔传感器卡盒（Agilent，#103344-100）在37°C无CO?条件下过夜水化。按制造商说明（Agilent，#103344-100）准备检测培养基和注射化合物。使用Seahorse Wave Controller Software 2.4进行分析。裂解细胞并定量每孔蛋白以标准化Seahorse数据。
### 免疫印迹
将细胞培养至60%至70%融合度，然后用指定浓度的SU056处理24或48小时。处理结束后，收集细胞并用补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER裂解液（Thermo Fisher Scientific，#78503；#78440）裂解。蛋白质通过4%至12%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。蛋白质随后转印至聚偏二氟乙烯膜上（Bio-Rad，#162-01277）。封闭后的膜用特异性一抗孵育，然后用相应的辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗进行检测，使用Immobilon Crescendo Western HRP底物（Millipore）显色，在iBright成像系统（Thermo Fisher Scientific）上可视化。使用的一抗和二抗包括：YB-1（Cell Signaling Technology，#8475）、GAPDH（Cell Signaling Technology，#8884）和抗兔IgG HRP偶联抗体（Cell Signaling Technology，#7074）。
### 全蛋白组谱分析
U2OS和SaOS细胞用对照溶剂或SU056（3 μmol/L）处理24小时。细胞洗涤后在100 mmol/L三乙胺碳酸氢盐（Thermo Fisher Scientific）中加入1% SDS裂解。样品按制造商方案（TMTsixplex Isobaric Label Reagent Set，Thermo Fisher Scientific，#90061）进行处理和TMT标记。将1 μg TMT标记肽段使用UltiMate 3000 RSLCnano系统（Thermo Fisher Scientific）注入PepMap C18 Neo捕集柱（Thermo Fisher Scientific）。肽段在加热的（65°C）25 cm长C18分析柱上分离，该柱由实验室自行装填BEH C18、130 ?、粒径1.7 μm填料（Waters）。缓冲液A（水中0.1%甲酸）保持98%，缓冲液B（乙腈中0.1%甲酸）在前6分钟保持2%，流速0.3 μL/min。在6至130分钟之间，缓冲液B梯度至35%，然后在5分钟内升至85%并保持5分钟。分析柱在下一次进样前用2%缓冲液B平衡10分钟。洗脱肽段使用Flex Ion离子源（1.8 kV）电离，耦联Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。MS1前体离子的质量扫描范围设为375至1,800 m/z，质量分辨率为50,000，以固定碰撞能38%进行高能碰撞诱导解离。循环扫描时间设为最高速度1秒。归一化AGC目标和最大注入时间分别设为标准和自动。
动态排除功能已启用，持续时间为60秒，质量容差为±10 ppm。MS2扫描范围设置为正常模式，定义范围为110至1,800 m/z。碎片离子在Orbitrap检测器中被检测，质量分辨率为50,000。归一化AGC靶值设置为200%，最大注入时间为86毫秒。配对骨肉瘤样品中YBX1的表达
18对骨肉瘤骨组织与正常样本的完整转录组数据（GSE99671；参考文献28）从NCBI基因表达综合数据库网站下载，使用DESeq2 R包（29）进行分析并进行统计显著性检验，使用GraphPad Prism（版本10）软件作图。
体内小鼠模型与药物疗效研究
所有动物实验均经美国俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用计划审查并批准。雌性Balb/c小鼠（品系编号028；Charles River Laboratories），7至8周龄，在标准实验室条件下饲养。将K7M2细胞以1:1比例重悬于1× PBS/Matrigel（Corning）溶液中，每只小鼠皮下注射0.25×10?个细胞。定期监测肿瘤生长情况，当肿瘤体积达到50至100 mm3时，开始给予溶剂对照（40% PEG-300溶于生理盐水）或SU056（50 mg/kg体重，口服灌胃，每周5天）治疗。每周测量肿瘤大小两次。治疗结束后，通过深度麻醉后颈椎脱臼安乐死小鼠。收集血液、脾脏和肿瘤组织。每个肿瘤的一部分及所有脾脏被制成单细胞悬液并冷冻保存，用于后续流式细胞术分析。为制备小鼠肿瘤单细胞悬液，将组织手动切碎后，用含2 mg/mL胶原酶A（Roche）的溶液在37°C下消化约30分钟。细胞通过70 mm尼龙滤膜过滤，并在1,200转/分钟下离心5分钟收集细胞沉淀。每个肿瘤的剩余部分经中性缓冲甲醛固定用于免疫组化分析。在SU056 +抗PD-1（BioXcell，BE0146；RRID: AB_10949053）组合研究中，如上述方法接种0.3×10? K7M2细胞。治疗方案包括：SU056（50 mg/kg体重，口服灌胃，每周5天）、抗PD-1（10 mg/kg体重，腹腔注射，每4天一次）、SU056（50 mg/kg，口服）联合抗PD-1（10 mg/kg，腹腔注射），或大鼠IgG2a同型对照抗体（BioXCell，BE0089；RRID: AB_1107769）。每周测量肿瘤大小两次。治疗结束后，收集血液、脾脏和肿瘤组织进行流式细胞术和免疫组化分析。
流式细胞术
约1×10?个肿瘤细胞在冰上孵育30分钟，使用Fcy受体结合抑制剂（BD Biosciences，553141）1:200和Live/Dead Aqua活/死染料（Invitrogen，L34966）1:1,000的溶液。然后在冰上用荧光标记的单克隆抗体在FACS缓冲液（PBS，5% FCS，1 mmol/L EDTA）中孵育30分钟。随后用FACS缓冲液洗涤细胞，用透化/固定缓冲液（eBioscience，88-8824-00）进行透化，用1×透化缓冲液洗涤，然后在FACS缓冲液溶液中用荧光标记抗体对细胞内抗原进行染色，冰上孵育30分钟。细胞样本在Cytek Aurora光谱流式细胞仪（Cytek Biosciences）上采集，数据通过FlowJo软件分析。本工作由OHSU流式细胞术和单克隆抗体共享资源中心（RRID:SCR_009974）支持。以下是所用抗体的详细信息：CD45（BD Horizon，564279；RRID:AB_2651134）、CD3（BD Horizon，612803；RRID:AB_2870130）、CD4（BD Horizon，751486；RRID:AB_2875482）、CD8（BD Horizon，612898；RRID:AB_2870186）、F4/80（BioLegend，123141；RRID:AB_2563667）、CD206（BioLegend，141708；RRID:AB_10900231）、NKp46（BioLegend，137630；RRID:AB_2616666）、CD19（BD Horizon，612971；RRID:AB_2870243）、颗粒酶B（Invitrogen，358898-82；RRID:AB_2848329）、Ki67（BD Horizon，566109；RRID:AB_2739511）、Foxp3（Invitrogen，69-5773-82；RRID:AB_2637367）、MHC I类分子（MHC I；Invitrogen，12-5998-81；RRID:AB_466121）、PD-1（BD Horizon，562523；RRID:AB_2737634）和PD-L1（BioLegend，124319；RRID:AB_2563619）。
结果
YBX1高表达与肉瘤患者生存率降低相关
两项观察结果——YBX1高表达与肉瘤患者无进展生存期和总生存期缩短相关（图1A；参考文献30），以及骨肉瘤肿瘤组织中YBX1表达显著高于正常组织（来自GSE99671；图1B；参考文献28）——使我们假设YB-1是骨肉瘤的潜在治疗靶点。为表征人和小鼠骨肉瘤细胞系中YB-1的表达，我们通过Western blot检测了五条小鼠骨肉瘤细胞系（K7M2、mOS13、mOS69、61236、61323）和四条人源细胞系（143B、OS17、SaOS、U2OS）的YB-1蛋白表达。虽然所有检测的骨肉瘤细胞系均表达YB-1，但我们发现小鼠细胞系的YB-1表达水平存在差异，其中61236表达水平最高，mOS69表达水平最低（图1C）。相比之下，人源骨肉瘤细胞系的YB-1表达水平较为一致（图1C）。此外，我们发现了两个高表达YB-1的患者来源异种移植瘤模型（PDX；295-R和323-R）（图1D）。这些结果表明，这些骨肉瘤模型反映了骨肉瘤中观察到的YB-1表达情况（21，22），并提示它们是评估在骨肉瘤中靶向YB-1进行治疗的效应的良好模型。
图1. 查看大图/下载幻灯片 YBX1高表达与骨肉瘤患者生存率降低相关。A，Kaplan-Meier曲线显示YBX1表达对肉瘤患者总生存期的影响，n=259（30）。B，18对骨肉瘤骨组织与正常样本（GSE99671）的YBX1完整转录组数据。数据以均值±标准差表示。**，P=0.003。与各自对照组相比，配对t检验显示差异显著。C和D，Western blot显示YB-1蛋白表达。C，小鼠（左）和人（右）骨肉瘤细胞系中的YB-1表达。D，骨肉瘤PDX模型中的YB-1表达。GAPDH作为上样对照。
图1. 查看大图/下载幻灯片 YBX1高表达与骨肉瘤患者生存率降低相关。A，Kaplan-Meier曲线显示YBX1表达对肉瘤患者总生存期的影响，n=259（30）。B，18对骨肉瘤骨组织与正常样本（GSE99671）的YBX1完整转录组数据。数据以均值±标准差表示。**，P=0.003。与各自对照组相比，配对t检验显示差异显著。C和D，Western blot显示YB-1蛋白表达。C，小鼠（左）和人（右）骨肉瘤细胞系中的YB-1表达。D，骨肉瘤PDX模型中的YB-1表达。GAPDH作为上样对照。关闭图1。
SU056处理在体外减少骨肉瘤肿瘤生长
SU056是卵巢癌和三阴性乳腺癌模型中YB-1表达的强效抑制剂（23，24）；因此，我们提出SU056是否在骨肉瘤中同样抑制YB-1的问题。我们用SU056处理人源骨肉瘤细胞系U2OS和SaOS以及小鼠骨肉瘤细胞系K7M2达24小时，通过Western blot监测YB-1表达。确实，与卵巢癌和三阴性乳腺癌类似，SU056在所有三条受测骨肉瘤细胞系中显著降低了YB-1蛋白表达（图2A）。
图2. 查看大图/下载幻灯片 SU056抑制骨肉瘤细胞的生长。A，Western blot检测SU056处理后YB-1蛋白降解情况。B，使用MTT法评估SU056的细胞生长抑制效果，并确定IC50值。C，细胞在含不同浓度SU056条件下培养7至10天的集落形成实验。治疗结束后，集落用结晶紫染色并扫描观察汇合度。每条细胞系显示代表性的孔板。D，PI染色后进行流式细胞术细胞周期分析。细胞经SU056处理24小时后，通过流式细胞术分析细胞周期阻滞情况。E，孵育9天后定量球体形成。球体在10倍放大倍数下成像，并定量球体面积。数据以均值±标准差表示，通过单因素方差分析后Tukey检验与各自对照组进行比较。
图2. 查看大图/下载幻灯片 SU056抑制骨肉瘤细胞的生长。A，Western blot检测SU056处理后YB-1蛋白降解情况。B，使用MTT法评估SU056的细胞生长抑制效果，并确定IC50值。C，细胞在含不同浓度SU056条件下培养7至10天的集落形成实验。治疗结束后，集落用结晶紫染色并扫描观察汇合度。每条细胞系显示代表性的孔板。D，PI染色后进行流式细胞术细胞周期分析。细胞经SU056处理24小时后，通过流式细胞术分析细胞周期阻滞情况。E，孵育9天后定量球体形成。球体在10倍放大倍数下成像，并定量球体面积。数据以均值±标准差表示，通过单因素方差分析后Tukey检验与各自对照组进行比较。关闭图2。
在已知SU056降低YB-1表达的基础上，我们评估了SU056处理对多条骨肉瘤细胞系细胞生长速率和存活率的影响。使用MTT法评估不同浓度SU056处理48小时后的细胞存活率百分比，随后计算每条细胞系的IC50值。SU056降低了所有受测骨肉瘤细胞系的细胞存活率（图2B），IC50值从143B的307 nmol/L到U2OS的5.4 μmol/L不等。这种IC50值的差异与YB-1的相对表达水平无明显相关性。因此，为检验SU056活性对YB-1表达的依赖性，我们使用两种不同的shRNA载体（YBX1-shRNA1和YBX1-shRNA2）通过慢病毒转导在SaOS和U2OS细胞中敲低YB-1，并测试了SU056的疗效。Western blot分析确认了YB-1的敲低效率（补充图S1A）。在这些YB-1敲低细胞系中，与转导对照相比，SU056的IC50增加了约1.5至2倍，表明SU056的显著效应依赖于YB-1的细胞内表达（补充图S1B）。接下来，我们评估了SU056处理对骨肉瘤集落形成能力的影响。与细胞存活率结果一致，SU056在所有细胞系中以剂量依赖方式显著减少了集落数量，与未处理对照组相比差异明显（图2C）。特别是，143B和OS17对SU056表现出明显的敏感性，仅用400 nmol/L SU056处理后，集落形成分别减少了20%和52.2%。与SU056的IC50类似，集落形成对SU056处理的反应也受YB-1敲低的影响。在U2OS和SaOS细胞系中，shRNA1和shRNA2细胞对SU056集落抑制的敏感性均低于转导对照（补充图S1C）。在先前的报道中，使用siRNA在MG63和MNNG骨肉瘤细胞中敲低YB-1可抑制72小时后的G1-S期转换（22）；因此我们提出SU056处理是否在143B、OS17、SaOS和U2OS骨肉瘤细胞系中重现了这一表型。为评估SU056处理24小时后对细胞周期进程的影响，骨肉瘤细胞经PI染色后通过流式细胞术分析。结果在各细胞系之间存在差异，但G2-M期阻滞在143B、SaOS和U2OS细胞中较为普遍。在143B细胞中，G2-M期细胞百分比在5 μmol/L SU056处理下增至40.7%，而对照组为22.2%。类似地，在SaOS细胞中，G2-M期细胞百分比在5 μmol/L处理下增至45.3%，而对照组为27.3%（图2D）。相比之下，尽管SU056限制了OS17的克隆形成能力（图2C），但其对OS17细胞周期分布的影响最小（图2D）。最后，我们检测了SU056抑制球体形成的能力，球体形成是癌症干细胞的替代指标。确实，SU056显著限制了K7M2细胞的球体形成，进一步证实了SU056的生长抑制效果（图2E）。为确定SU056降低YB-1蛋白表达的机制（图2A），基于数据显示SU056在乳腺癌中诱导蛋白酶体介导的YB-1降解（23），我们假设SU056在骨肉瘤中也以类似方式发挥作用。为验证这一点，我们将U2OS细胞用蛋白酶体抑制剂MG132联合SU056处理。我们发现MG132部分挽救了SU056诱导的YB-1蛋白水平降低（补充图S1D），表明与乳腺癌的结果类似，SU056通过蛋白酶体促进YB-1降解。
然而，部分逆转现象提示可能还有其他机制也起到作用，明确精确的机制将是未来研究的重点。综合来看，这些结果表明SU056通过降解途径抑制YB-1，从而有效抑制骨肉瘤肿瘤在体外生长的多个方面。SU056治疗可减少骨肉瘤肿瘤在体内的生长
SU056已被证明具有安全的药物特性，在最大耐受剂量测试中，小鼠以高达400 mg/kg体重的剂量接受SU056给药，未出现可观察到的毒性反应（23）。此外，SU056在50 mg/kg的剂量下已被证明对卵巢癌和三阴性乳腺癌具有抗癌效果（23, 24）。因此，为了在体内验证我们的体外结果，我们在荷K7M2瘤的小鼠中测试了SU056，K7M2瘤是一种骨肉瘤同基因小鼠模型，SU056在该模型中可减少YB-1表达并限制集落形成潜能和球体形成（图3）。在这些实验中，我们将K7M2细胞皮下接种到Balb/c小鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm3时，我们开始每日口服50 mg/kg SU056或Vehicle对照（图3A）。结果显示，与对照组相比，SU056使肿瘤生长减少了高达72%（P < 0.0037），肿瘤重量减少了59%（P < 0.0267；图3B和C）。小鼠体重未受治疗的任何影响，支持了先前关于毒性最小的报道。总体而言，这些结果证实了YB-1在骨肉瘤肿瘤生长中的作用（22），并证明SU056在体内对骨肉瘤具有显著的抗肿瘤效果。图3.查看大图 下载幻灯片 SU056在体内抑制骨肉瘤肿瘤生长。A，同基因小鼠研究的实验设计示意图。将K7M2细胞皮下接种到Balb/c小鼠侧腹。当肿瘤体积达到50–100 mm3时，开始给予SU056（50 mg/kg）或Vehicle对照。B，肿瘤体积随时间变化的曲线图。C，研究结束时各组小鼠的肿瘤重量。柱状图表示各治疗组的平均肿瘤重量。数据以每组10只小鼠的均值±标准差表示，通过Mann-Whitney t检验或Welch t检验与各自对照组进行比较。图3.查看大图 下载幻灯片 SU056在体内抑制骨肉瘤肿瘤生长。A，同基因小鼠研究的实验设计示意图。将K7M2细胞皮下接种到Balb/c小鼠侧腹。当肿瘤体积达到50–100 mm3时，开始给予SU056（50 mg/kg）或Vehicle对照。B，肿瘤体积随时间变化的曲线图。C，研究结束时各组小鼠的肿瘤重量。柱状图表示各治疗组的平均肿瘤重量。数据以每组10只小鼠的均值±标准差表示，通过Mann-Whitney t检验或Welch t检验与各自对照组进行比较。关闭 图3. SU056治疗导致骨肉瘤细胞的全局蛋白质组改变
为了研究SU056对骨肉瘤细胞的影响，我们进行了无偏的蛋白质组学分析，以确定受SU056治疗影响的生物学通路。在该分析中，我们选择了两条人骨肉瘤细胞系U2OS和SaOS，用3 μmol/L SU056或Vehicle对照培养。24小时后，将细胞裂解液通过液相色谱/串联质谱进行蛋白质组学分析，随后进行基因集富集分析（GSEA）。我们发现SU056对U2OS和SaOS的影响相当相似（图4A），表明尽管敏感性不同，SU056的效果仍然一致。在这些细胞系中，我们发现SU056治疗调节了与蛋白质翻译相关的通路，与SU056在三阴性乳腺癌中发现的效果相似（图4B；参考文献23）。有趣的是，蛋白质组学分析还揭示，SU056治疗后参与葡萄糖代谢的蛋白质上调（图4D和E）。因此，为了直接验证SU056改变骨肉瘤糖酵解速率的假说，我们对U2OS细胞使用了Seahorse实验，发现在一系列浓度范围内SU056对糖酵解速率没有影响（补充图S2）。这一差异的一个解释可能来自一份近期报告，该报告显示YB-1缺乏通过其对丙酮酸脱氢酶E1亚基α1（PDHA1）活性的直接影响，导致丙酮酸氧化严重受损，而PDHA1是三羧酸循环的限速酶，这可能解释了SU056处理细胞中糖酵解酶的增加（31）。图4.查看大图 下载幻灯片 SU056治疗导致骨肉瘤细胞的全局蛋白质组改变。A–E，用SU056（3 μmol/L）或Vehicle对照处理U2OS和SaOS细胞24小时。将细胞裂解液通过液相色谱/串联质谱进行蛋白质组学分析，随后进行GSEA。A，SU056治疗后调节分子的 heatmap 表示。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001；*****，P < 0.00001。B和D，SU056治疗后蛋白质相关生物学通路减少和增加的图表。C和E，使用GSEA的癌症标志物分析。图4.查看大图 下载幻灯片 SU056治疗导致骨肉瘤细胞的全局蛋白质组改变。A–E，用SU056（3 μmol/L）或Vehicle对照处理U2OS和SaOS细胞24小时。将细胞裂解液通过液相色谱/串联质谱进行蛋白质组学分析，随后进行GSEA。A，SU056治疗后调节分子的 heatmap 表示。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001；*****，P < 0.00001。B和D，SU056治疗后蛋白质相关生物学通路减少和增加的图表。C和E，使用GSEA的癌症标志物分析。关闭 图4. 使用GSEA进行癌症标志物分析（32），我们发现SU056的一个有趣效应是，与抵抗细胞死亡相关的蛋白质在SU056治疗后下调（图4C）。抵抗细胞死亡所必需基因的 下调可能提示这些细胞对诱导细胞死亡的治疗将更为敏感，例如多柔比星，这是骨肉瘤常用的标准治疗化疗药物（33）。因此，在两条骨肉瘤细胞系U2OS和143B中，我们使用MTT检测法评估了SU056与多柔比星之间的协同作用，可能表明在SU056存在的情况下骨肉瘤对多柔比星的敏感性增加。为确定协同作用，我们使用Chou-Talalay法计算了CI值，发现143B和U2OS细胞中SU056与多柔比星联合治疗的CI值均<1，表明这两种疗法在该细胞系中存在显著的协同作用（补充图S3）。SU056改变肿瘤免疫微环境
有趣的是，参与抗原加工和呈递的蛋白质被SU056上调（图4A和B）。具体而言，SU056上调了tapasin（TAPBP）。Tapasin是存在于内质网腔中的MHC I类抗原加工分子，在MHC I分子的成熟中发挥重要作用。肿瘤细胞上MHC I的上调可能提示具有更活跃的抗肿瘤反应潜力；因此，我们提出了一个问题，即除肿瘤MHC I表达外，SU056治疗是否也影响更广泛的骨肉瘤肿瘤微环境（TME），这可能表明SU056增加了对手性疗法如ICB（例如αPD-1）的敏感性。为评估SU056对骨肉瘤TME的影响，我们将接受每日口服50 mg/kg SU056或Vehicle对照治疗后（见图3A示意图）荷K7M2瘤小鼠的肿瘤取出，制备肿瘤单细胞悬液用于流式细胞术分析。首先，为了通过这种正交方法确认我们的蛋白质组学数据，我们检查了MHC I的表达，发现在SU056治疗后，肿瘤细胞[CD45?（P = 0.005）]和CD45?造血细胞的MHC I表达均有增加，证实了蛋白质组学数据的结果（图5A）。通常，骨肉瘤肿瘤被认为是免疫学上的"冷"肿瘤，表明它们未被免疫细胞充分浸润，且很可能具有免疫抑制性的TME。因此，为评估TME，我们检测了SU056治疗是否增加了总CD45?免疫细胞向肿瘤的浸润。我们发现SU056治疗后活细胞中CD45?造血细胞的频率显著增加（P = 0.019），表明SU056可能刺激了骨肉瘤中更"免疫热"的环境（图5B）。由于SU056引起的MHC I增加，我们假设治疗后骨肉瘤的免疫环境抑制性较弱。为探讨这一问题，我们观察了TAMs，它们可呈现M1（抗肿瘤）或M2（促肿瘤）表型（34），并有助于塑造TME。我们观察到SU056治疗后F4/80? TAMs的频率略有增加但无统计学显著性（图5C），但在这些TAMs中，CD206? TAMs的构成比例显著降低（P = 0.0016），CD206是调节性M2样TAM的标志物（图5D）。此外，我们还观察到另一种免疫抑制细胞CD4?Foxp3? Tregs的频率降低（P = 0.04；图5E）。M2 TAMs和Tregs的减少提示SU056治疗可能诱导了免疫刺激性的TME。事实上，我们还发现SU056治疗后存在活跃的抗肿瘤反应的证据，因为SU056处理显著增加了颗粒酶阳性的细胞毒性CD8?和NK细胞的频率[CD8?GzmB?（P = 0.0247），NKp46?GzmB?（P = 0.0212）；图5F]，提示激活程度增加。然而，我们注意到SU056治疗后总CD4? T细胞和NK细胞的频率降低，所有CD8? T细胞的频率未发生变化（补充图S4），这可能提示虽然SU056促进了更允许抗肿瘤活性发挥的TME，但它可能不会促进显著的T细胞增殖或迁移。YB-1已被证明可促进PD-1表达（20）；因此，通过减少YB-1，SU056可能也减少PD-1表达，这一效应可能有助于指导与免疫疗法联合使用的策略。因此，我们检查了SU056治疗后免疫细胞上的PD-1和肿瘤细胞上的PD-L1表达，发现表达水平未发生变化（补充图S5）。总之，这些数据提示SU056可能通过重塑TME使其呈现抑制性较弱、更"免疫热"的表型来发挥部分抗肿瘤作用，并可能提示能够促进活性淋巴细胞浸润的免疫疗法（如抗PD-1）将与SU056产生协同效应。图5.查看大图 下载幻灯片 SU056改变肿瘤免疫微环境。A，对照组和SU056处理组小鼠中CD45表达的代表性伪彩图。B，TME中F4/80?巨噬细胞的数量。C，对照组和SU056处理组小鼠中F4/80?巨噬细胞上CD206表达的代表性直方图叠加图。D，对照组和SU056处理组小鼠中CD4?Foxp3?表达的代表性伪彩图。E，对照组和SU056处理组小鼠中CD8? T细胞和NK细胞上颗粒酶B表达的代表性直方图叠加图。F，SU056处理后小鼠肿瘤中CD45阴性和CD45阳性群体MHC I表达的代表性直方图叠加图。数据以均值±标准差表示，通过单因素方差分析后Tukey检验与各自对照组进行比较，n = 5–6。图5.查看大图 下载幻灯片 SU056改变肿瘤免疫微环境。A，对照组和SU056处理组小鼠中CD45表达的代表性伪彩图。B，TME中F4/80?巨噬细胞的数量。C，对照组和SU056处理组小鼠中F4/80?巨噬细胞上CD206表达的代表性直方图叠加图。D，对照组和SU056处理组小鼠中CD4?Foxp3?表达的代表性伪彩图。E，对照组和SU056处理组小鼠中CD8? T细胞和NK细胞上颗粒酶B表达的代表性直方图叠加图。F，SU056处理后小鼠肿瘤中CD45阴性和CD45阳性群体MHC I表达的代表性直方图叠加图。数据以均值±标准差表示，通过单因素方差分析后Tukey检验与各自对照组进行比较，n = 5–6。关闭 图5. SU056治疗使肿瘤对抗PD-1免疫疗法的应答敏感性增加
基于我们发现SU056可增强免疫细胞浸润、诱导免疫刺激性TME且不改变PD-1和PD-L1表达的结论，我们假设SU056将与ICB疗法抗PD-1产生协同作用。为验证这一假设，荷K7M2瘤小鼠分别接受以下治疗：单独SU056（每日，50 mg/kg口服灌胃）、单独抗PD-1（10 mg/kg腹腔注射，每3天一次）、SU056联合抗PD-1，或IgG2a同型对照。正如预期，基于ICB在骨肉瘤中的最小应答（10–12），单独抗PD-1治疗不影响K7M2肿瘤生长（图6B和C）。同样如预期，SU056单药治疗与对照组相比显著减少了骨肉瘤肿瘤生长（图6B和C）。
我们发现，SU056与抗PD-1的联合治疗对肿瘤生长的抑制作用更为显著，且显著提高了生存率，显示出比任一单药治疗更好的抗骨肉瘤疗效（图6B-D）。我们通过计算每日肿瘤生长速率，将两项独立实验的数据进行合并；这些数据表明，与抗PD-1单药治疗相比，联合治疗组的肿瘤生长显著减少（图6E）。
图6. 大图 下载幻灯片 SU056增强肿瘤对抗PD-1免疫治疗的敏感性。A，同源小鼠实验的实验设计示意图。将K7M2细胞皮下移植至Balb/c小鼠体侧。当肿瘤体积达到50-100 mm3时，开始给予SU056（50 mg/kg）、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗。B，以时间为函数的肿瘤体积。C，研究结束时小鼠的肿瘤重量。柱状图代表每个治疗组的平均肿瘤重量。D，展示经SU056、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。E，根据两项独立实验，计算每个治疗组每日肿瘤生长速率。F，柱状图代表经SU056、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗后免疫群体（M2巨噬细胞、NK细胞、CD4? T细胞和CD8? T细胞）的平均值。G，柱状图代表经治疗后增殖性CD4? T细胞和NK细胞群体的平均值。数据以每组6只小鼠的均值±标准差表示，通过与各自对照组进行比较，采用Mantel-Cox检验或单因素方差分析后接Tukey检验。
图6. 大图 下载幻灯片 SU056增强肿瘤对抗PD-1免疫治疗的敏感性。A，同源小鼠实验的实验设计示意图。将K7M2细胞皮下移植至Balb/c小鼠体侧。当肿瘤体积达到50-100 mm3时，开始给予SU056（50 mg/kg）、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗。B，以时间为函数的肿瘤体积。C，研究结束时小鼠的肿瘤重量。柱状图代表每个治疗组的平均肿瘤重量。D，展示经SU056、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。E，根据两项独立实验，计算每个治疗组每日肿瘤生长速率。F，柱状图代表经SU056、抗PD-1、SU056联合抗PD-1或载体对照治疗后免疫群体（M2巨噬细胞、NK细胞、CD4? T细胞和CD8? T细胞）的平均值。G，柱状图代表经治疗后增殖性CD4? T细胞和NK细胞群体的平均值。数据以每组6只小鼠的均值±标准差表示，通过与各自对照组进行比较，采用Mantel-Cox检验或单因素方差分析后接Tukey检验。关闭图6.
我们提出，通过流式细胞术检查治疗后肿瘤，是否可以检测到免疫驱动的解释来阐明SU056与抗PD-1联合治疗中观察到的疗效增强。我们发现，SU056单药治疗后观察到的M2（F4/80?CD206?）肿瘤相关巨噬细胞（TAM）频率降低在联合治疗中得以维持，表明免疫刺激性肿瘤微环境（TME）的维持（图6F）。此外，联合治疗后，我们观察到CD4? T细胞和NK细胞的整体频率增加，逆转了SU056单药治疗后的减少趋势；然而，我们也观察到CD8? T细胞频率的轻微但无统计学意义的降低（图6F）。最后，我们询问NK细胞和CD4? T细胞的增加是否可能由于这些亚群的增殖增加所致，并与SU056单药治疗相比，未发现Ki67? NK细胞或CD4? T细胞的频率变化（图6G），提示这些细胞在肿瘤中的增加更可能源于转运增加。
讨论
骨肉瘤是青少年和年轻成年人中最常见的原发性骨肿瘤。尽管过去30年来付出了大量努力，骨肉瘤的预后基本未变（1, 2），反映了对对抗该疾病的新型疗法的迫切需求。在本研究中，我们证明SU056——一种新型小分子YB-1抑制剂——通过直接的肿瘤细胞细胞毒性和肿瘤微环境（TME）调节，在骨肉瘤中表现出强效的抗肿瘤活性。SU056在体外抑制骨肉瘤细胞生长，并在体内显著减少肿瘤生长，无明显毒性迹象。这些结果突显了SU056治疗骨肉瘤的治疗潜力。此外，SU056增强了免疫检查点阻断（ICB）疗法的疗效。综合来看，这些发现确立了SU056作为骨肉瘤有前景的治疗候选药物，无论是单药治疗还是与ICB联合使用。
我们此前已在卵巢癌和三阴性乳腺癌（TNBC）中鉴定出SU056是一种强效的YB-1抑制剂，在其中SU056减少了癌细胞集落形成，诱导细胞周期阻滞（在卵巢癌中为sub-G1期和G1期，在TNBC中为G2-M期），并增加凋亡（23, 24）。我们在骨肉瘤中发现SU056治疗产生了类似的结果，SU056显著减少集落形成并诱导sub-G1期细胞周期阻滞。在蛋白质水平上，SU056的效果在这三种癌症类型中存在差异。在TNBC中，SU056的主要效果是增加蛋白质翻译过程。在卵巢癌中，SU056治疗后有多个通路发生改变，包括凋亡、RNA降解，以及有趣的是，T细胞受体信号通路（24）。在骨肉瘤中，我们观察到抵抗细胞死亡的过程下调，以及抗原加工和呈递机制上调，提示存在独特的免疫学效应。在所有三种肿瘤类型中，这些体外观察结果一致地转化为体内显著抑制肿瘤生长。在骨肉瘤中，与对照组相比，SU056治疗后肿瘤体积减少了50%以上。除了这些令人鼓舞的治疗结果外，在非荷瘤小鼠和大鼠中的毒理学和药代动力学研究表明，SU056耐受性良好，无不良反应。以100至400 mg/kg的剂量给予SU056（治疗剂量的八倍），未观察到可观察的行为、神经或解剖学毒性迹象（23）。总体而言，这些数据提供了有力证据，表明SU056可能是骨肉瘤的有效治疗策略，具有强效的直接抗肿瘤作用和良好的安全性特征。
除了其肿瘤内在效应外，SU056还在肿瘤微环境中发挥免疫调节活性。流式细胞术分析骨肉瘤肿瘤浸润免疫细胞显示，SU056治疗后免疫抑制性群体（包括Treg和M2极化TAM）显著减少。这些发现提示SU056可能将肿瘤微环境重编程为更具免疫刺激性的状态。这与先前将YB-1与免疫抑制性细胞浸润联系起来的报告一致，因为YB-1敲低导致荷瘤小鼠（Hepa 1-6）肿瘤中MDSC和Treg浸润减少（19）。此外，YB-1对IL4表达至关重要，并且在26种癌症类型中与CD4? Th2细胞显著正相关，提示YB-1可能通过增加癌细胞中的IL4水平促进CD4? T细胞分化（35）。作为Th2细胞因子，IL4削弱关键免疫通路——限制巨噬细胞活化，减少IFNγ信号传导，并抑制DC IL12产生——这些都是有效抗PD-1介导的抗肿瘤免疫所必需的。因此，SU056促进较少抑制性肿瘤微环境的一个潜在机制可能是通过YB-1抑制减少IL4。例如，Che及其同事（35）发现YB-1影响RAN表达，RAN是Ras GTPase家族的成员，对IL4表达至关重要，导致可能存在YB-1/RAN/IL4信号通路的可能性，该通路可被SU056破坏。有趣的是，支持这一假设的是，我们的蛋白质组学分析显示，SU056治疗骨肉瘤细胞导致RAN表达显著减少（图4A）。SU056介导肿瘤微环境重塑的另一可能机制是通过限制YB-1对IL2 mRNA的稳定，IL2是一种关键的细胞因子，驱动T细胞增殖，对于维持Treg至关重要（36）。我们发现SU056限制了肿瘤微环境中的Treg，这可能是IL2减少的下游效应。此外，当SU056与抗PD-1联合给药时，我们发现与SU056单药治疗相比，CD4? T细胞的频率增加，但我们未发现有增殖增加的证据，这可能提示IL2可用性降低。IL2疗法是早期用于对抗癌症的成功免疫疗法之一（37）；因此，如果SU056治疗后IL2受限，将SU056与IL2疗法联合使用可能代表增强抗肿瘤免疫反应的途径。最后，YB-1是HIF-1α已知的上游调节因子，这提供了影响肿瘤微环境的另一途径。抑制HIF-1α已被证明可增加CD8? T细胞浸润，提高颗粒酶B表达，并促进M2 TAM极化（38, 39）。考虑到YB-1是HIF-1α已知的上游调节因子，SU056治疗观察到的肿瘤微环境变化可能是通过调节HIF-1α信号通路，至少部分地介导的（21）。综合来看，YB-1下游有许多可能影响肿瘤微环境的潜在信号通路。SU056诱导的肿瘤微环境重塑转化为对免疫检查点阻断（ICB）的改善响应。YB-1信号轴此前已被直接连接到免疫检查点的调节和表达，将YB-1确定为免疫抑制性肿瘤微环境的贡献者。例如，在肝细胞癌（HCC）和三阴性乳腺癌（TNBC）中，人PD-L1启动子区域有一个Y-box序列，可被YB-1结合并激活以促进PD-L1转录（19, 20）。此外，PD-1转录本的翻译已被证明在TNBC中由YB-1促进（20）。在HepG2细胞和T细胞的体外共培养实验中，YB-1敲低由于PD-L1的丧失，增加了免疫刺激性细胞因子TNFα和INFγ，并减少了免疫抑制性细胞因子IL1β、IL10和TGFβ（19）。与来自HCC和TNBC的数据（19, 20）相反，我们未发现通过SU056治疗敲低YB-1显著改变了骨肉瘤体内淋巴细胞上的PD-1表达或肿瘤细胞（CD45?细胞）上的PD-L1表达（补充图S5）；然而，虽然无统计学意义，我们确实观察到SU056治疗后表达PD-1的CD45?细胞轻微减少。这一趋势提出了YB-1抑制适度减少PD-1表达的可能性，尽管不足以排除与抗PD-1的协同效应。SU056治疗后PD-1和PD-L1表达的这些微小变化使我们的假设是SU056将与PD-1阻断疗法协同。确实，SU056与抗PD-1观察到的协同效应突显了探索替代ICB伙伴的潜力，如抗CTLA-4或抗LAG-3，或细胞因子疗法如IL2，它们可能代表更有效的联合伙伴。总体而言，我们发现SU056增强了抗PD-1疗法的疗效，导致比任一药物单独使用更大的骨肉瘤肿瘤生长抑制。这种协同效应支持了我们关于SU056使肿瘤对ICB敏感的假设，可能通过减少免疫抑制和促进效应T细胞功能。鉴于目前骨肉瘤ICB单药治疗成功有限（40），我们的结果为克服免疫抵抗提供了一种有前景的策略。总之，本研究确定了SU056作为骨肉瘤有前景的治疗策略，展示了强效的肿瘤内在细胞毒效应以及将肿瘤微环境重编程为抗肿瘤免疫的能力。重要的是，SU056增强了抗PD-1疗法的活性，我们建议这种协同效应可能源于更广泛的免疫调节效应，如M2巨噬细胞和Treg频率减少。然而，本研究的一个局限是它高度依赖K7M2同源模型。未来在额外模型上的研究，包括PDX和自发骨肉瘤模型，将提高我们发现的转化相关性。总体而言，我们的结果突显了YB-1作为骨肉瘤中肿瘤进展和免疫逃逸的新兴可靶向驱动因子的潜力，并将SU056定位为进一步转化开发的有力候选者。旨在确定最佳免疫治疗伙伴并阐明SU056活性机制基础的未来研究对于推进这种方法在骨肉瘤患者中的临床转化至关重要，这些患者迫切需要新的治疗选择。
数据可用性
蛋白质组学数据已存入PRIDE档案，通过PRIDE合作伙伴数据库（https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/），数据集标识符为PXD074439。
