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锌指蛋白143通过c-Myc双向调控肝细胞与肝细胞癌细胞的增殖转录因子锌指蛋白143（ZNF143）在调控多种生物学过程中发挥关键作用，包括细胞周期进程、发育和细胞分化。同样，c-Myc已被确认为细胞增殖、分化和代谢稳态的关键调控因子。尽管已有研究证实ZNF143参与正常肝细胞和肝癌细胞的增殖调控，但ZNF143介导肝细胞增殖调控的精确机制，以及其在该过程中与c-Myc潜在的功能性相互作用，仍有待充分阐明。在本研究中，研究人员利用2/3部分肝切除术（PHx）小鼠模型，探究了ZNF143和c-Myc在肝再生不同阶段的动态表达模式。为阐明这些因子在肝细胞增殖中的调控作用，研究人员采用小鼠正常肝细胞系AML12和人肝癌细胞系Huh7作为实验模型。通过MTT、CCK-8、EdU、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot实验，研究人员检测了ZNF143和c-Myc单独及联合作用对肝细胞增殖的影响。研究结果表明，ZNF143在AML12细胞中抑制增殖和细胞周期进程，但在Huh7细胞中促进这些过程。值得注意的是，在AML12细胞中ZNF143和c-Myc的共过表达（OE）抑制了细胞增殖和细胞周期进程，提示ZNF143在正常肝细胞中对c-Myc发挥主导性调控作用。本研究为探讨ZNF143在体内肝细胞增殖中的作用奠定了重要基础，对肝再生和移植治疗具有潜在意义。 论文解读文章 一、研究背景与科学问题 肝脏是机体最主要的代谢器官，具有非凡的再生能力。肝再生过程中肝细胞的增殖、生长和分化对于维持肝脏功能和稳态至关重要。然而，肝再生的分子机制涉及复杂的转录因子和信号通路网络，亟需深入探究再生相关基因及其机制以推动治疗发展。 ZNF143是一种含七个锌指结构域的转录调控因子，主要参与细胞周期进程和DNA复制。在多数系统中，ZNF143通常促进细胞增殖，例如在肝细胞癌（HCC）中，ZNF143通过激活组蛋白去甲基化酶MDIG的转录，进而上调CDC6表达以驱动肿瘤细胞增殖。然而，研究人员前期研究已证实ZNF143在正常肝细胞中表现出相反的生长抑制功能，其过表达（OE）可抑制大鼠BRL-3A肝细胞的增殖。原癌基因c-Myc作为另一关键转录调控因子，在控制基因表达程序和细胞周期检查点调控中发挥重要作用，c-Myc缺失必然导致细胞周期阻滞。已有报道指出ZNF143主要在G2/M期发挥作用，而c-Myc在G0/G1期发挥作用，两者参与细胞周期调控的时相不同。尽管ZNF143和c-Myc均与细胞增殖和细胞周期相关，但二者协同调控肝细胞周期的机制仍不清楚。 已有证据表明，ZNF143作为c-Myc的上游转录因子，通过调控c-Myc表达参与相关生物学功能。然而，ZNF143与c-Myc协同调控肝细胞增殖的机制仍不明确。基于此，研究人员首先检测了肝再生不同阶段ZNF143和c-Myc的表达，随后利用小鼠正常肝细胞AML12和人肝癌细胞Huh7两种细胞系，探究二者单独及联合作用对增殖和细胞周期进程的影响，评估细胞周期相关基因表达的变化，并阐明ZNF143在该过程中是否对c-Myc发挥主导性调控作用。该研究为深入探讨ZNF143调控肝细胞增殖以介导体内肝再生过程提供了重要线索。 二、主要技术方法 本研究采用2/3部分肝切除术（PHx）小鼠模型，选取8周龄雄性C57BL/6小鼠，在术后0、2、36、48、72和168小时共6个时间点采集肝组织，每个时间点3只小鼠，共18只。体外实验使用小鼠正常肝细胞系AML12（ATCC，CRL-2254）和人肝癌细胞系Huh7（中国科学院上海生命科学研究院，SCSP-526），均经支原体检测确认无污染。研究采用短发夹RNA（shRNA）和小干扰RNA（siRNA）实现ZNF143及c-Myc的敲低，通过质粒构建实现过表达。功能检测采用MTT法、CCK-8法、EdU标记实验评估细胞活力与增殖，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测mRNA表达水平，采用Western blot检测蛋白表达水平，以GAPDH作为内参。数据以均值±标准误（SEM）表示，组间差异采用独立t检验分析，p<0.05视为具有统计学意义。 三、研究结果 3.1 肝再生不同阶段ZNF143和c-Myc的动态表达 在2/3 PHx小鼠模型中，肝重与体重比值的恢复证实了肝再生的成功。在mRNA和蛋白水平上，ZNF143和c-Myc在再生的起始期和增殖期均呈现动态变化且趋势相反。具体而言，在36小时，c-Myc显著上调而ZNF143显著下调。在PHx后48–168小时期间，二者表达趋势仍保持相反。值得注意的是，48小时时ZNF143 mRNA几乎检测不到，但其蛋白水平相对显著，研究人员推测该时间点ZNF143蛋白半衰期远长于其mRNA半衰期；而c-Myc mRNA相对丰富，但其蛋白几乎检测不到，这可能归因于c-Myc蛋白固有的短半衰期以及体内蛋白酶体介导的快速降解。 3.2 ZNF143抑制正常肝细胞的体外增殖 研究人员构建了稳定的ZNF143敲低AML12细胞系，qRT-PCR证实ZNF143 mRNA表达降低84.5%。CCK-8、MTT和EdU实验显示，ZNF143敲低显著促进AML12细胞的活力和增殖。ZNF143敲低后，CCNA2、CCND1、CCNB1、CCNE1、c-Jun和PCNA在mRNA和蛋白水平均显著上调。相反，在AML12细胞中过表达ZNF143则显著降低细胞活力和增殖，并显著抑制上述细胞周期和增殖相关基因的表达。这些结果表明ZNF143在体外是正常肝细胞增殖的抑制因子。 3.3 ZNF143促进HCC细胞的体外增殖 研究人员合成了靶向人ZNF143的siRNA转染Huh7细胞，qRT-PCR证实敲低效率为58%。CCK-8、MTT和EdU实验显示ZNF143敲低显著降低Huh7细胞的活力和增殖。然而，qRT-PCR和Western blot分析显示，ZNF143敲低后Huh7细胞中细胞增殖和细胞周期相关基因的mRNA和蛋白水平显著升高。相反，利用pcDNA3.1-ZNF143质粒过表达ZNF143则显著增强Huh7细胞的活力和增殖。总体而言，ZNF143促进Huh7细胞增殖。 3.4 ZNF143与c-Myc协同抑制肝细胞增殖 在肝再生增殖期，研究人员观察到ZNF143表达下调而c-Myc表达上调。在正常肝细胞中，ZNF143上调抑制增殖，而c-Myc上调促进增殖。研究人员构建了稳定的c-Myc敲低AML12细胞系，实验显示c-Myc敲低抑制AML12细胞的活力和增殖。进一步研究发现，在AML12细胞中，ZNF143过表达显著抑制c-Myc表达，而ZNF143敲低显著促进c-Myc表达。因此，在AML12细胞中，c-Myc是促进肝细胞增殖的调控因子，而ZNF143通过抑制c-Myc表达来减弱肝细胞的增殖潜能。 当在AML12细胞中共过表达ZNF143和c-Myc时，虽然c-Myc部分抵消了ZNF143的抑制作用，但肝细胞增殖仍受到抑制，细胞周期和增殖相关基因的表达仍显著受抑。这些发现表明，ZNF143和c-Myc共过表达抑制AML12细胞增殖，ZNF143通过抑制c-Myc表达来维持正常肝细胞的特性，防止过度增殖。 四、讨论总结与研究结论 讨论总结： ZNF143在多种实体瘤中高表达，其靶基因多与细胞增殖相关。然而，ZNF143在细胞增殖中的作用具有复杂性和多样性，可依据细胞环境发挥促进或抑制增殖的双重作用。c-Myc在细胞增殖、分化和代谢调控中发挥关键作用，其激活可增强肝再生。ZNF143和c-Myc均可通过上调MDIG介导H3K9me3去甲基化，但作用于不同靶基因位点，在HCC增殖和肝再生中发挥不同作用。ZNF143缺失可显著下调c-Myc靶基因，提示二者存在直接或间接的交互作用。在本研究中，共过表达ZNF143和c-Myc对AML12细胞增殖的影响与单独过表达ZNF143一致，结合文献报道，研究人员认为c-Myc的表达受ZNF143调控，从而实现细胞增殖的精准调控。研究结果提示c-Myc和ZNF143在调控细胞增殖中发挥不同作用，可能在肝再生过程中共同调控肝细胞增殖，以防止过度再生及后续的癌变。 研究结论翻译： 作为转录因子，ZNF143通常与染色质组织蛋白CCCTC结合因子（CTCF）共同介导环状结构的形成。然而，近期报道表明ZNF143的主要功能是调控其靶基因，独立于环状结构和CTCF。在本研究中，研究人员发现ZNF143在正常肝细胞（AML12）中抑制细胞增殖，但在肝癌细胞（Huh7）中增强增殖，而c-Myc在两种细胞系中均促进增殖。c-Myc的表达受ZNF143负调控。此外，在AML12细胞中，ZNF143和c-Myc同时过表达的增殖效应与单独过表达ZNF143相似。因此，研究人员提出ZNF143作为调控细胞增殖的关键转录因子，在肝细胞增殖调控中发挥主导作用。虽然本研究探讨了ZNF143和c-Myc协同表达对肝细胞增殖的影响，但具体分子机制仍不清楚。未来将进一步探索ZNF143抑制正常肝细胞增殖的分子机制，并研究ZNF143和c-Myc如何调控靶基因H3K9me3的改变以发挥各自功能。总之，研究结果表明ZNF143在HCC和正常肝细胞中发挥不同作用，并与c-Myc协同调控肝细胞增殖，可被视为肝脏疾病的潜在治疗靶点。 |
