摘要
越来越多的研究认识到肿瘤微生物在调节肿瘤行为和治疗反应中的作用。对多种癌症的肿瘤内微生物负担（ITMB）分析显示，这些微生物能够调控免疫途径并激活肥大细胞，尤其是在结直肠癌和胃癌中。高ITMB的结直肠癌会导致干扰素（IFN）的调节，并与晚期疾病患者的预后改善相关。单细胞测序显示，在含有微生物的结直肠癌中，与IFN相关的基因（IRG）被诱导表达。胃肠道腔内错配修复缺陷（MMRd）肿瘤的ITMB水平高于正常肿瘤。在一个经过免疫检查点阻断（ICB）治疗后100%缓解的直肠MMRd患者队列中，肿瘤微生物和含有微生物的肥大细胞数量增加。在ICB敏感的转基因小鼠MMRd肿瘤模型中，局部清除肿瘤微生物会降低ICB的效果，同时抑制IFN信号通路。在ADA-R1缺陷癌细胞中强制上调IRG表达后，微生物清除能够恢复免疫治疗反应。这些数据突显了ITMB、宿主防御机制和肿瘤免疫原性之间的动态相互作用，这似乎是决定治疗反应的关键。
意义：肿瘤内的微生物负担与转录和免疫功能变化相关，这些变化似乎决定了肿瘤对免疫治疗的敏感性。这些发现强调了肿瘤内驻留微生物在塑造肿瘤生态系统中的关键作用，这可能成为调节治疗反应的目标。
引言
许多研究已经报告了肠道微生物组组成与化疗、免疫治疗和放疗临床反应之间的关联（1-8）。一些研究表明，在免疫检查点阻断（ICB）治疗前和治疗期间接受抗生素治疗的免疫治疗反应良好的患者，其无进展生存期和总生存期（OS）较短（7-11）。不同研究中，与治疗效果相关的细菌种类不同，这表明微生物负担可能比微生物组成对治疗结果的影响更大。最近的研究表明，肿瘤内存在独特的微生物生态系统，与皮肤或胃肠道（GI）的共生微生物群不同（12, 13）。我们报告了高肿瘤微生物多样性、独特的肿瘤微生物组特征、免疫激活状态以及胰腺导管腺癌患者预后改善之间的关系（12）。相关研究还发现，乳腺癌中的某些细胞内微生物能够调节宿主细胞骨架，从而促进转移性定植（14, 15）；在部分结直肠癌患者中，肿瘤微生物会影响肿瘤进展并通过降低局部药物效果来调节化疗反应（16）。最近的研究对于结直肠癌中的优势菌种Fusobacterium在调节免疫治疗反应中的作用提出了相反的观点（17, 18）。尽管ICB技术取得了诸多进展，但临床反应率和疗效持续时间仍然存在很大差异，某些肿瘤类型中甚至没有效果（19-22）。癌症免疫治疗反应率的提高归因于更高的突变负担、PD-L1表达以及肿瘤浸润淋巴细胞的增多（23-26）。鉴于这些复杂性，我们假设肿瘤内的微生物负担而非个别菌种可能以一种在肿瘤内具有异质性的方式指导免疫反应。在此研究中，我们对人类结直肠癌肿瘤进行了单细胞水平的DNA测序（DNA-seq）和RNA测序（RNA-seq），以确定微生物负担，并通过临床前实验模型和下游效应信号通路的评估来解析相关的转录变化。我们的发现强调了肿瘤内微生物在塑造肿瘤生态系统中的作用，这最终会影响肿瘤行为和治疗反应。
结果
肿瘤内微生物负担主要与结直肠癌和胃癌中的免疫途径密切相关
我们开发了一种快速的分类注释方法，并将其性能与全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）的细胞系数据集以及计算机模拟对照组进行了对比。利用这种方法，我们通过评估每个样本中非污染微生物DNA相对于宿主DNA的水平来确定肿瘤内微生物负担（ITMB），这种方法称为微生物丰度聚合（Aggv1；见“方法”部分；补充图S1A和S1B）。我们分析了癌症基因组图谱（TCGA）中的七种实体瘤类型的ITMB：结直肠癌、胃癌、乳腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫体子宫内膜癌、非小细胞肺癌和胰腺腺癌。正如预期的那样，结直肠癌的ITMB最高，其次是胃癌（见图1A），这两种都属于胃肠道腔内肿瘤类型。为了确定主要受肿瘤微生物负担调控的功能途径，我们比较了不同肿瘤类型中高ITMB和低ITMB肿瘤之间的基因表达（见“方法”部分）。总体而言，基因集富集分析（GSEA）和基因本体论（GO）评分显示，高ITMB的结直肠癌与免疫相关途径的关联最为紧密（见图1B）。胃癌是上调免疫途径数量第二多的肿瘤类型，但非免疫途径的下调更为显著。其余肿瘤类型的调控较为温和，主要是非免疫途径。A、TCGA数据显示的I至IV期结直肠癌患者的总生存率（Prob）。B和C、TCGA数据评估了具有错配修复能力（MMRp）与错配修复缺陷（MMRd）的结直肠癌（B）和胃癌（STAD；C）肿瘤中的微生物丰度。D、使用dostarlimab进行PD-1阻断前后，从16名患者获取的活检样本中评估细菌负荷和宿主蛋白质的工作流程示意图。αPD-1，抗PD-1。E、治疗前（左）和治疗后（中）患者活检样本的代表性图像，染色显示CK（白色）、αSMA（粉色）、肥大细胞胰蛋白酶（红色）和16SrRNA探针（绿色）。右侧，使用Visiopharm进行细胞分割以分析细胞组成。F-H、治疗后活检样本中的平均16S菌落（F）、胰蛋白酶阳性细胞丰度（G）以及含有微生物的胰蛋白酶阳性细胞（H）显著增加。（D，由Liu, H.（2026）使用BioRender制作。https://BioRender.com/d6oc3j0。）P值使用学生t检验（非配对，双尾）进行计算；?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001，或????P< 0.0001。图2。查看大图下载幻灯片
ITMB在结直肠癌（CRC）中具有预后意义，并且在MMRd肿瘤中富集。A、TCGA数据显示的I至IV期结直肠癌患者的总生存率（Prob）。B和C、TCGA数据评估了具有错配修复能力（MMRp）与错配修复缺陷（MMRd）的结直肠癌（B）和胃癌（STAD；C）肿瘤中的微生物丰度。D、使用dostarlimab进行PD-1阻断前后，从16名患者获取的活检样本中评估细菌负荷和宿主蛋白质的工作流程示意图。αPD-1，抗PD-1。E、治疗前（左）和治疗后（中）患者活检样本的代表性图像，染色显示CK（白色）、αSMA（粉色）、肥大细胞胰蛋白酶（红色）和16SrRNA探针（绿色）。右侧，使用Visiopharm进行细胞分割以分析细胞组成。F-H、治疗后活检样本中的平均16S菌落（F）、胰蛋白酶阳性细胞丰度（G）以及含有微生物的胰蛋白酶阳性细胞（H）显著增加。（D，由Liu, H.（2026）使用BioRender制作。https://BioRender.com/d6oc3j0。）P值使用学生t检验（非配对，双尾）进行计算；?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001，或????P< 0.0001。关闭图2。鉴于已知错配修复缺陷（MMRd）肿瘤中免疫检查点的差异表达以及它们总体上更好的预后，我们使用TCGA数据评估了MMRd肿瘤与MMRp肿瘤中的微生物负担，并发现结直肠癌和胃癌肿瘤类型中的ITMB显著增加（图2B和C）。在评估个别微生物种类时，如先前报道的，在MMRd结直肠癌中发现了脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）、核梭菌（Fusobacterium nucleatum）和其他微生物种类的相对丰度较高（补充图S5A–S5C）。接下来，我们参考了我们团队的一项最新研究，其中局部晚期MMRd直肠癌患者获得了100%的完全持久临床反应率，从而无需标准护理的化疗、手术或放疗（22）。为了确定肥大细胞和细菌负担是否可能是动态变化的，并可能与这些极端反应有关，我们分析了16名患者在接受dostarlimab治疗前后（治疗开始后1.5–6个月）的活检样本（见“方法”部分）。为了同时评估细菌负荷和宿主蛋白质，我们对活检样本进行了组织化学染色，检测活化肥大细胞（胰蛋白酶）、细胞角蛋白（CK）和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA），并使用RNAscope荧光原位探针在同一切片上进行了多路16S rRNA染色。我们使用自动化定量分析软件Visiopharm，在感兴趣的区域首先进行细胞分割和细胞分型，然后量化感兴趣细胞内的16S rRNA菌落数量。这种微生物负担的量化显示，免疫治疗后微生物负担显著增加（图2E和F）。分析细菌在肿瘤微环境中的空间分布显示，细菌与癌细胞和肥大细胞共定位。此外，ICB治疗后含有微生物的浸润性肥大细胞显著增加（图2G和H）。总的来说，这些数据揭示了ITMB的预后价值，它在MMRd肿瘤中的富集情况，以及肥大细胞和微生物之间的共定位，以及它们在整个治疗过程中的动态调节，这可能有助于肿瘤消退。
接下来，我们假设肿瘤微生物可能调节癌细胞内的免疫途径。为了验证这一点，我们首先验证了确定单个癌细胞内微生物负担的方法。我们在体外将KPC肿瘤细胞暴露于预定的细菌（大肠埃希菌（Escherichia coli）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和脆弱拟杆菌（B. fragilis），这些细菌单独或组合添加（补充图S6A和S6B）。然后，我们使用两种对照样本类型（计算机模拟和未暴露的细胞）通过全DNA单细胞测序（whole-DNA single-cell sequencing）来基准测试识别的微生物种类。同时，我们进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq, 10x Genomics）以检测微生物种类，并发现使用这种方法可以在预孵育一种或组合微生物后准确地检测到预期的微生物（补充图S6C）。验证这种方法后，我们消化了人类结直肠肿瘤组织（n = 3），以获得用于单细胞DNA测序（scDNA-seq）和10x 5′ scRNA-seq的单细胞悬浮液，以识别肿瘤微生物种类（见“方法”部分）。我们旨在比较含有微生物（ITMB+）和不含微生物（ITMB?）的癌细胞之间的转录特征，并确定微生物存在对肿瘤细胞中功能途径的影响（图3A）。我们应用了严格的过滤标准以最小化潜在的微生物组污染。在整个测序过程中，使用HT29细胞系作为对照。首先，scRNA-seq中在超过15个总对照细胞中检测到的任何微生物种类都被认为是污染物并予以移除。同样，scDNA-seq中在多个对照细胞中检测到的种类也被排除。接下来，保留了在scRNA-seq和scDNA-seq中都检测到的微生物，以便进一步去除污染。最后，我们手动审查了剩余的物种，并将其与文献中的报道进行交叉参考，以去除那些在结直肠癌或人类样本中之前被报告为污染物的物种，结果选择了247种微生物（图3B和C；补充表S2）。经过严格的质量控制（QC）后，保留了10,584个高质量细胞以供后续分析。基于转录组谱图的无监督聚类识别出八个非恶性细胞簇和一个肿瘤细胞簇，每个簇都有独特的表达谱，这些簇基于簇特异性差异表达基因（DEG；图3D；补充图S7A和S7B）和先前研究中的标记物（29–31）。肿瘤细胞通过标记基因EPCAM、CDH1、KRT8、KRT18和KRT19进行鉴定。我们专注于肿瘤细胞，并根据是否含有微生物（ITMB?）将它们分为两组（图3E；补充图S7C）。然后我们基于ITMB比较了肿瘤细胞中的基因表达谱。我们共识别出1,615个DEGs，其中包括ITMB+细胞中的1,564个上调基因和51个下调基因（补充图S7D）。接着我们关注功能途径，发现多个与IFN相关的基因（IRG）在个别ITMB+肿瘤细胞中上调（图3F），GSEA分析独特地显示ITMB+肿瘤细胞中IFNα反应的富集（图3G）。图3。查看大图下载幻灯片
ITMB在单细胞水平上调控IRGs（干扰素相关基因）。A、实验设计，展示了通过scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq确定结直肠癌（CRC）患者肿瘤细胞中ITMB的流程。B、scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq共同检测到的前50种微生物种类。C-E、使用scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq识别肿瘤微生物种类的工作流程（C），目的是比较ITMB+肿瘤细胞与ITMB?肿瘤细胞的转录特征，并通过无监督聚类识别出九个簇（D），根据是否含有微生物（ITMB?）将它们分为两组（ITMB?）与至少检测到一个微生物读段（ITMB+；E）。CAF，癌症相关成纤维细胞；UMAP，均匀流形逼近和降维。F、火山图显示了在肿瘤簇中识别的DEGs，突出了25个上调的IRGs。G、GSEA结果显示ITMB+结直肠癌肿瘤细胞中IFNα响应基因的显著富集[标准化富集得分（NES）= 1.21；调整后（adj）P = 0.02]。Mono&Macro，单核细胞和巨噬细胞。（A，由Liu, H.（2026）使用BioRender制作。https://BioRender.com/cgpfodi。）图3。查看大图下载幻灯片
ITMB在单细胞水平上调控IRGs。A、实验设计，展示了通过scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq确定结直肠癌（CRC）患者肿瘤细胞中ITMB的流程。B、scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq共同检测到的前50种微生物种类。C-E、使用scDNA-seq和10x 5′ scRNA-seq识别肿瘤微生物种类的工作流程（C），目的是比较ITMB+肿瘤细胞与ITMB?肿瘤细胞的转录特征，并通过无监督聚类识别出九个簇（D），根据是否含有微生物（ITMB?）将它们分为两组（ITMB?）与至少检测到一个微生物读段（ITMB+；E）。CAF，癌症相关成纤维细胞；UMAP，均匀流形逼近和降维。F、火山图显示了在肿瘤簇中识别的DEGs，突出了25个上调的IRGs。G、GSEA结果显示ITMB+结直肠癌肿瘤细胞中IFNα响应基因的显著富集[标准化富集得分（NES）= 1.21；调整后（adj）P = 0.02]。Mono&Macro，单核细胞和巨噬细胞。（A，由Liu, H.（2026）使用BioRender制作。https://BioRender.com/cgpfodi。）关闭图3。综上所述，这些发现表明，微生物负担较高的单个结直肠癌细胞表现出IFN相关通路的上调。
局部肿瘤微生物的清除逆转了免疫治疗反应
由于具有较高ITMB的结直肠癌在整体组织和单细胞水平上显示出增强的免疫激活，我们假设肿瘤微生物负担可能调节免疫治疗反应。为了验证这一假设，我们在对PD-1阻断敏感的MC38和EO771肿瘤模型中清除了肿瘤内的微生物（图4A）。为了清除肿瘤微生物，将抗生素混合物（氨苄西林、万古霉素、甲硝唑和两性霉素B）注射到肿瘤周围区域，这导致肿瘤微生物负担显著减少（图4B和C），而在已知对免疫治疗敏感的皮下MC38和同基因型EO771异种动物模型中，肠道微生物组的丰度保持不变（图4D和E）。图4。查看大图下载幻灯片
局部肿瘤微生物的清除逆转了免疫治疗反应。A、通过P.T. ATBx治疗清除肿瘤周围微生物的示意图，并使用临床前MC38和EO771模型研究对ICB的反应。αPD-1，抗PD-1。B-E、通过P.T. ATBx注射减少了肿瘤微生物负担（B和C），而在皮下MC38和EO771同基因型肿瘤模型中，肠道微生物组的丰度保持不变（D和E），这些模型通过16S qPCR测量。Cont，对照组。F和G、评估P.T. ATBx治疗对皮下MC38（F）和EO771同基因型肿瘤（G）中PD-1阻断的治疗效果。H、通过P.T. ATBx治疗后MC38肿瘤中肥大细胞胰蛋白酶的IHC染色和量化，按组织面积（mm2）标准化。I、使用WT和KitW-sh/W-sh小鼠中的MC38模型研究对ICB的反应的示意图。J、在WT和KitW-sh/W-sh小鼠中植入的MC38肿瘤中肥大细胞胰蛋白酶的IHC染色和量化，按组织面积（mm2）标准化。K、在WT和KitW-sh/W-sh小鼠中植入的MC38肿瘤中的肿瘤微生物负担，通过16S qPCR测量。L、评估WT和KitW-sh/W-sh小鼠中MC38肿瘤中PD-1阻断的效果。ns，无统计学意义。P值使用学生t检验（非配对，双尾）进行计算，对于两组；对于≥2组使用ANOVA；?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001，或????P< 0.0001。图4。查看大图下载幻灯片I. 使用MC38模型研究WT和KitW-sh/W-sh小鼠对ICB反应的示意图。J. 在WT和KitW-sh/W-sh小鼠体内植入的MC38肿瘤中，通过组织面积（mm2）标准化对肥大细胞豚草酶进行IHC染色和定量。K. 通过16S qPCR测量WT和KitW-sh/W-sh小鼠体内植入的MC38肿瘤中的肿瘤微生物负担。L. 评估PD-1阻断在WT和KitW-sh/W-sh小鼠的MC38肿瘤中的疗效。ns表示无统计学显著性。P值使用Student’s t检验（非配对，双尾）对2组数据进行计算，对于≥2组的数据使用ANOVA进行计算；?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001，或????P< 0.0001。关闭图4。接下来，我们评估了PD-1阻断在肿瘤特异性微生物清除中的治疗效果。尽管未经微生物清除的对照组肿瘤对PD-1阻断有高度反应，但在接受周围抗生素（P.T. ATBx）治疗的肿瘤中，无论是在MC38皮下肿瘤模型（图4F；补充图S8A）还是EO771原位模型（图4G；补充图S8B）中，都不再对PD-1抑制产生反应。我们通过比较PD-1阻断与P.T. ATBx联合使用与单独使用PD-1阻断的效果来确认肿瘤微生物负担的减少（补充图S8C）。我们还发现，在P.T. ATBx治疗下，肿瘤浸润的活化肥大细胞数量减少，而CD117+和CD63+细胞数量保持不变，这表明活化肥大细胞是响应微生物存在而特异性地被招募到肿瘤中的（图4H；补充图S8D和S8E）。值得注意的是，提前终止P.T. ATBx治疗未能逆转PD-1阻断的效果，这表明持续的微生物清除是维持抗性表型的必要条件（补充图S8F）。在两种模型中都检测到特定微生物种类的变化，包括Blautia的减少，尽管仅在EO771中观察到乳酸菌的减少（补充图S9A和S9B）。最后，鉴于肿瘤内微生物负担与肥大细胞浸润之间的关联，我们想知道肥大细胞是否介导了微生物对免疫治疗反应的影响。为此，我们使用了基因工程改造的缺乏肥大细胞的小鼠（KitW-sh/W-sh；参考文献32），首先确认它们确实缺乏肥大细胞（图4I和J）。我们植入了皮下MC38肿瘤，并评估了微生物负担，发现其与对照组小鼠相比没有变化（图4I和K）。然后我们测试了肥大细胞对肿瘤生长的功能影响，发现缺乏肥大细胞的小鼠的MC38肿瘤生长速度较慢（尽管不显著）；然而，与WT小鼠相比，它们也没有从额外的免疫治疗中获得改善（图4L）。这表明肥大细胞的缺乏并不能完全模拟局部微生物清除的效果，肥大细胞可能起着独立的作用。综上所述，这些数据强烈表明肿瘤微生物影响了免疫治疗反应，并引发了肥大细胞的浸润，而肥大细胞似乎并不是微生物效应的主要介导者。
为了进一步研究肿瘤微生物相关的免疫治疗敏感性机制，我们对局部微生物清除后的小鼠肿瘤组织进行了RNA-seq分析。在MC38模型中，局部微生物清除后下调的基因通过GO通路分析显示细胞对IFNs的反应、免疫细胞趋化性以及趋化因子信号通路的下调，反映了肿瘤微生物在调节宿主免疫反应中的作用（图5A；补充图S10A）。图5。查看大图下载幻灯片：癌细胞中IRGs的微生物调节驱动免疫治疗敏感性。A. 在P.T. ATBx处理后，对MC38肿瘤的批量RNA-seq中下调的DEGs进行GO通路富集分析，突出了与IFN相关的通路。B. ADAR1调控的IRG产生的示意图。C. Western印迹显示ADAR1 KD MC38细胞克隆1中的表达减少。D. 在体外通过qPCR测量ADAR1 KD MC38细胞克隆1与对照（Cont）克隆中IRGs的标准化表达。E. 通过P.T. ATBx处理清除肿瘤内微生物，并使用ADAR1 KD MC38研究对ICB的反应。F. 评估在P.T. ATBx处理后的皮下ADAR1 KD MC38肿瘤中抗PD-1（αPD-1）的疗效。G. 通过qPCR测量在P.T. ATBx处理后ADAR1 KD MC38肿瘤组织中IRGs的标准化表达。ns表示无统计学显著性。（B，在BioRender中创建。Liu, H. (2026) https://BioRender.com/jprr3x0。）P值使用Student’s t检验（非配对，双尾）对2组数据进行计算，对于≥2组的数据使用ANOVA进行计算；?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001，或????P< 0.0001。图5。查看大图下载幻灯片：癌细胞中IRGs的微生物调节驱动免疫治疗敏感性。到目前为止，我们从人类结直肠癌的批量和单细胞测序以及小鼠局部微生物清除模型中获得了多个证据，关于微生物在调节癌细胞内IFN相关通路中的作用。由于已知微生物能够诱导线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），这是一种关键的微生物传感器，参与调节IFN反应，我们假设微生物对IRGs的调节是免疫治疗敏感性的原因。由于ADAR1是MAVS的负调节因子，并且调节自身免疫，我们在MC38癌细胞中下调了ADAR1蛋白表达，以测试微生物依赖性免疫治疗反应中对IRGs的需求（图5B）。简而言之，我们用慢病毒将小鼠Adar short hairpin RNA（shRNA）转染到WT MC38细胞中，这些shRNA克隆在pLKO.1载体中，通过Western印迹确认了ADAR1（p110和p150两种异构体）的敲低（KD）（图5C）。随后，我们在同源动物中皮下植入了这些细胞，并观察到原始表型的显著恢复，因为当IRGs被人工引入肿瘤时（图5G），ADAR1 KD肿瘤在局部微生物清除后仍然对PD-1阻断有反应，这突显了IRGs在决定免疫治疗反应中的作用。
肿瘤微生物组在调节宿主免疫系统中的作用尚未完全明了（4-8）。已知微生物是多种癌症中肿瘤微环境的关键组成部分（12, 13），我们提出高微生物负担可能解释了某些肿瘤对ICB治疗效果良好的原因。相比之下，像胰腺癌或脑癌这样的微生物负担较低的肿瘤对免疫治疗的反应较差。事实上，长期生存的胰腺癌患者具有更高的肿瘤微生物多样性（12）。动态的微生物组-宿主相互作用显著影响肿瘤进展和治疗反应。我们的发现强调了肿瘤微生物负担与免疫检查点分子之间的相互作用，这些分子会损害肿瘤微环境中的肥大细胞功能。在最近的一项研究中，肠致病性B. fragilis在APC/BRAF突变小鼠中的定植增加了肥大细胞的浸润及其与IFN信号通路相关的基因表达（33）。细菌基因毒素通过引入单链DNA和双链DNA（dsDNA）断裂来导致DNA损伤，并调节STAT3和NF-κB的表达，这些基因是癌变过程中激活的主要促炎通路相关基因（34-37）。同样，我们的数据显示胃肠道腔内肿瘤具有较高的微生物负担，这与STAT3和NF-κB以及CD274的上调有关。我们还观察到结直肠癌和胃癌的MMRd肿瘤中微生物负担和α多样性增加，这些肿瘤在临床上对免疫治疗的反应更好（21, 38, 39）。我们发现肿瘤内微生物丰度与活化肥大细胞之间存在直接关联，肥大细胞是先天免疫系统中宿主防御的关键效应细胞，对于控制细菌负担至关重要（40）。肥大细胞通过释放组胺和豚草酶来调节肿瘤微环境，促进肝细胞癌、胆管癌和乳腺癌的进展，并产生IFNγ和一氧化氮，这些因素有利于髓系来源的抑制性细胞活性，同时分泌TNFα，后者在胃癌中被描述为抑制抗肿瘤免疫（41-44）。我们发现肥大细胞是由微生物负担驱动进入肿瘤的，因为当局部微生物被清除后，肥大细胞数量会减少，但在缺乏肥大细胞的小鼠中微生物数量没有变化。此外，肥大细胞并不复制局部抗生素的效果（抑制免疫治疗反应），这表明它们不是微生物效应的主要介导者。缺乏肥大细胞的小鼠肿瘤生长较慢（尽管不显著），并且它们似乎从免疫治疗中得不到额外的益处，正如之前描述的那样（45）。在MMRd肿瘤中，肥大细胞与ITMB之间的相互作用最为明显，这些肿瘤中免疫检查点表达水平很高，肥大细胞也表达PD-L1（43, 46）。一旦引入PD-1阻断，肥大细胞会大量涌入，同时促进肿瘤的清除。所使用的样本来自原发性MMRd直肠癌，其中100%的病例肿瘤被完全清除（22）。这些数据显示，PD-1阻断预计会释放肿瘤特异性T细胞和其他适应性效应细胞，同时也导致肥大细胞的大量涌入，这些肥大细胞在基线时已经在MMRd肿瘤中以较高的数量存在。这可能增强了免疫反应对原发肿瘤的效力，与PD-L1水平高但ITMB水平低的肿瘤相比。最后，MMRd肿瘤中的高水平ITMB似乎仅限于那些暴露于高水平共生微生物的肿瘤（例如，胃肠道和皮肤），这些器官作为抵御微生物群、毒素和过敏原等环境刺激的物理屏障。在高水平ITMB的肿瘤中，IRGs的持续诱导可能导致功能性T细胞耗竭和检查点分子的表达增加。综上所述，这可能有助于解释在MMRd直肠肿瘤中观察到的前所未有的新辅助免疫治疗反应，而在其他情况下，原发肿瘤的完全清除较为罕见。我们的研究存在一些局限性需要考虑。（i）这些发现突显了使用原位小鼠模型研究胃肠道腔内和肿瘤内微生物在免疫治疗反应中的作用的重要性。评估肿瘤微生物的依赖性需要局部微生物清除，同时保持肠道微生物组不变，这在现有的原位模型方法中是一个具有挑战性的目标。（ii）理想情况下，微生物清除不应在肿瘤周围进行，因为这可能会以不均匀的方式影响肿瘤；然而，反复的肿瘤内注射会导致严重的肿瘤溃疡，因此不适合研究微生物的作用。（iii）由于目前可用的方法限制，我们没有在同一单个细胞上进行scDNA-seq和scRNA-seq。我们使用scDNA-seq的主要目的是为了确保数据的准确性和去除杂质。总之，我们的研究强调了肿瘤驻留微生物在塑造免疫治疗反应中的关键作用。我们在图6中总结了工作机制。肿瘤可能需要根据其基因组驱动因素、免疫特征和转录特征来重新定义，同时还需要根据其微生物负担来定义，当这些因素在空间上整合时，可能会定义出对确定新靶点和划分反应试验和生物标志物至关重要的肿瘤生态系统。图6。查看大图下载幻灯片：ITMB通过调节干扰素信号通路驱动免疫反应。在BioRender中创建。Liu, H. (2026) https://BioRender.com/qrxttww。BRCA：乳腺癌；CRC：结直肠癌；GBM：多形性胶质母细胞瘤；NSCLC：非小细胞肺癌；PAAD：胰腺腺癌；STAD：胃癌；UCEC：子宫体子宫内膜癌。图6。查看大图/下载幻灯片。
ITMB通过调节干扰素信号传导来驱动免疫反应。使用BioRender生成。Liu, H. (2026) https://BioRender.com/qrxttww。BRCA：乳腺癌；CRC：结直肠癌；GBM：多形性胶质母细胞瘤；NSCLC：非小细胞肺癌；PAAD：胰腺腺癌；STAD：胃癌；UCEC：子宫体子宫内膜癌。关闭图6。
方法
TCGA数据集获取
从Genomic Data Commons (GDC)仓库获取了TCGA WES数据（BAM格式），其中包括癌症类型和受试者信息（47）。使用Samtools提取未映射序列到配对端FASTQ文件，计算每个样本的总映射和未映射序列，以便进行后续分析。
微生物组 pipeline
首先使用FASTP算法（48）对原始下一代测序数据集（反映DNA-seq或RNA-seq文库）进行质量及长度预处理，目标碱基调用错误率<0.25%。使用Kraken2算法（49）对这些高质量通过的测序片段进行分类学分配，该算法经过调整以实现足够的灵敏度和特异性来检测微生物（置信度得分>0.03），并使用包含超过80,000种微生物和病毒成员的 curated数据库。同时将人类基因组添加到索引中，以便量化和过滤来自宿主的序列。将分类计数丰度标准化为每个样本检测到的宿主DNA的数量（每1亿宿主序列的观测单位）。为了评估该 pipeline 的预期性能并调整Kraken2置信度参数，使用了100种人类共生细菌的基因组来模拟配对端（2 × 150 bp）Illumina序列数据（每个基因组100万个读段对），误差率为每碱基对1%。为了评估错误地将人类序列归类为微生物的情况，模拟了一系列仅含人类的样本，这些样本反映了嵌合体形成和从1%到15%的碱基对错误率。此外，还通过一系列10个细胞系（WES：NCBI BioProject PRJEB30297）和10个Genome in a Bottle样本HG001（NCBI BioProject PRJNA200694）的WGS数据来评估生物信息学错误阳性调用风险。有关仿真基准测试的结果，请参见补充图S1。统计分析和可视化使用R（https://cran.r-project.org）生成。
微生物负担分层
为了提供TCGA癌症类型中ITMB的总体汇总测量，在相对于每个样本的宿主DNA水平进行标准化后，使用广义线性模型统计评估每个分类单元作为潜在污染物的可能性，该模型将log10转换后的丰度值与肿瘤和血液进行关联，并调整了受试者的癌症类型。那些具有显著正系数的分类单元（P < 0.01；在3,896个评估的分类单元中有355个）被认为是非污染物的，并在感兴趣的受试者组中分别进行评估（Aggv1）。如图1A和B所示，在随后评估ITMB的每种癌症类型中，使用Aggv1的中位数值作为临界值来确定高微生物负担状态与低微生物负担状态。在移除了FC变异最小的基因（绝对log2 FC低于0.02）之后，使用完整的排名基因列表来比较每种癌症类型中的高ITMB与低ITMB，这些列表作为输入用于clusterProfiler（50）执行GSEA以识别GO生物过程术语。如图1C-H和补充图S3所示，为了提供更具体的结直肠癌中ITMB的总体测量，收集了在TCGA结直肠癌样本集中相对丰度最高的20个肠道特异性分类单元的高置信度集合（AggHC20）。此外，鉴于其他团队（27）最近发表的研究结果，其中已经表征了肿瘤微生物的定量，我们对比了我们的数据，结果在补充图S2A-S2D中提供。使用AggHC20的中位数值作为临界值来确定高微生物负担状态与低微生物负担状态。使用完整的排名基因列表来比较高ITMB与低ITMB，这些列表作为输入用于clusterProfiler（50）执行GA SEA。绝对log2 FC高于0.5且调整后的P值低于0.05的基因被选为DEGs，用于volcano图可视化。
双RNAcope ISH-荧光多重IHC检测
首先根据Opal Multiplex IHC检测（Advanced Cell Diagnostics, Inc.）的方法对石蜡包埋的5-μm切片进行脱蜡和脱水处理。选择了CK（Dako）、αSMA（Invitrogen）、肥大细胞胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）和EB-16S-rRNA探针（ACDBio）作为标记物，并按照ACDBio协议进行染色步骤。使用Vectra Polaris成像系统（Akoya Biosciences, Inc.）以40倍放大率扫描切片。量化过程在德克萨斯大学MD Anderson癌症中心（MDACC）北校区的Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility的Visiopharm平台上进行。
细胞培养
从美国典型培养物收集（ATCC）购买的乳腺癌（EO771）细胞系以及C57BL/6衍生的MC38小鼠结肠腺癌细胞系及其衍生物在添加了4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为37°C和5% CO2的湿润环境。在所有细胞系进行任何肿瘤植入研究之前，都进行了支原体检测，确保无支原体存在。支原体检测在MDACC的Cytogenetics and Cell Authentication Core进行。
Adar shRNA构建
从MilliporeSigma获得了Adar的鼠shRNA质粒构建，分别为TRCN0000234067（目标序列：5′-GTCCCATGAACCTCGATTTAA-3′）和TRCN0000218395（目标序列：5′-GTGAATCCAGATAGTTGTATC-3′），以及一个非随机化的对照质粒，均基于慢病毒载体pLKO.1。
慢病毒生成
在不含抗生素的完全DMEM（添加了10% FBS和1 mmol/L丙酮酸）中，以每60-mm组织培养皿3.45e6细胞的密度接种Lenti-X细胞。过夜培养后，使用Lipofectamine 3000进行短暂转染，并将慢病毒包装质粒psPAX2、病毒包膜质粒pCMV-VSV-G和适当的转移质粒以1:0.54:1.26的摩尔比混合在Opti-MEM中。过夜转染后，将培养基更换为病毒收集培养基（添加了10% FBS、1×青霉素/链霉素和1 mmol/L丙酮酸的DMEM），并孵育48小时。收集慢病毒上清液，并通过500 × g离心7分钟进行澄清，然后通过0.45-μm聚醚砜（PES）真空过滤器过滤以去除细胞碎片，快速冷冻并存储在?80°C以备后续使用。
ADAR1 KD细胞系的生成
MC38细胞以每孔10的感染复数（MOI）转染两种独立的shRNA构建体，并在转染后48小时进行嘌呤霉素选择（2.5 μg/mL）。使用anti-ADAR1抗体（Santa Cruz Biotechnology，稀释度1:200）通过Western blotting确认单个细胞克隆中的ADAR1蛋白KD。
小鼠模型
所有动物实验均遵守并得到了德克萨斯大学MDACC的动物护理和使用委员会的批准。从Taconic Biosciences购买了4至5周龄的雌性C57BL/6小鼠。从The Jackson Laboratory购买了缺乏肥大细胞的KitW-sh/W-sh小鼠（库存编号#030764），并在德克萨斯大学MDACC的动物设施中繁殖，使用20-30周龄的小鼠。对于皮下小鼠模型，使用异氟烷（2%–3%异氟烷与1 L/分钟的氧气流速组合）对小鼠进行麻醉。将100 μL的PBS中的MC38细胞注射到小鼠侧腹皮下。对于乳腺癌原位小鼠模型的建立，将100 μL的PBS中的EO771细胞注射到第四乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到约50 mm3时，每隔一天腹腔注射一次抗–PD-1抗体（BioXCell），每次剂量为200 μg，对于MC38肿瘤的小鼠注射5至7次，对于EO771肿瘤的小鼠注射4次。肿瘤体积的计算公式为长度×宽度×宽度/2（单位为mm3）。在实验终点，收获肿瘤组织并进行进一步分析。
抗生素治疗
在小鼠肿瘤周围区域皮下注射含有氨苄西林（30 mg/kg，Unasyn）、万古霉素（15 mg/kg，PREMIERProRx）、甲硝唑（15 mg/kg，Pfizer）和两性霉素B（0.1 mg/kg，MP Biomedicals）的抗生素混合物。从肿瘤植入前6天开始每天注射抗生素，植入后的一天停止注射，然后重新开始并持续每天注射直至实验终点。实验中使用了药物级的抗生素。
组织和粪便DNA提取
使用QIAamp DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，69506）按照制造商的协议从肿瘤组织样本中提取基因组DNA，并进行了少量修改。简要来说，使用无菌剪刀将肿瘤组织切成小块。通过将组织与蛋白酶K一起孵育来实现裂解。为了确保有效裂解组织中的所有微生物细胞，在裂解步骤中额外添加了溶菌酶（70 mg/mL，Sigma-Aldrich，SAE0152），并在30°C下孵育30分钟。使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（QIAGEN）根据制造商的协议从小鼠粪便中提取细菌DNA。提取的DNA随后用作定量PCR（qPCR）的模板以检测微生物DNA。
微生物检测的qPCR
为了测量细菌的丰度，在ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）上使用PowerTrack SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）进行了qRT-PCR。使用了以下16S rRNA特异性引物：UniF334：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′；UniR514：5′-ATTACCGCGGCTGCTGGC-3′；1369F：5′-CGGTGAATACGTTCCCGG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PowerTrack SYBR Green Master Mix的循环条件为95°C 2分钟，然后是40个循环，每个循环分别为95°C 5秒和60°C 30秒，最后进行解离曲线分析。原始循环阈值（Ct）值与使用金黄色葡萄球菌（Norgen Biotek Corp.）生成的细菌标准曲线进行比较，以近似细菌负荷。
16S rRNA测序
MC38和EO771肿瘤组织样本被送往贝勒医学院的宏基因组学和微生物组研究中心，在那里使用Illumina MiSeq平台从V4引物区域生成16S rRNA基因序列文库，之前使用PowerMag Soil Isolation Kit（MO BIO Laboratories）提取了DNA。数据主要使用贝勒医学院宏基因组学和微生物组研究中心开发的Agile Toolkit for Incisive Microbial Analysis进行分析；然后，在审查了每个抗生素暴露组中的丰富分类单元后，我们将这些成员与关于常见16S rRNA相关污染物的文献进行了交叉参考，从而得出了以下背景相关分类单元的类别（51）：Burkholderiales、Rhizobiales、Caulobacterales、Actinomycetales、Bacillaceae、Sphingomonadales、Thermus和Gammaproteobacteria。
RNA提取
使用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）根据制造商的协议从肿瘤组织中提取总RNA。使用NanoDrop One对RNA进行洗脱和定量。通过2100 Bioanalyzer和RNA 600 Nano Kit（Agilent Technologies）确定从肿瘤组织中提取的RNA的质量和完整性（RIN）。为了合成cDNA，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit按照制造商的协议（Thermo Fisher Scientific）以最终反应体积20 μL逆转录1 μg的总RNA。
qPCR
为了测量mRNA表达，在ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）上使用Fast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）进行了实时qPCR。使用了以下引物对：Isg15（F-5′-CATCCTGGTGAGGAACGAAAGG-3′和R-5′-CTCAGCCAGAACTGGTCTTCGT-3′）；Isg20（F-5′-GCCATTTGGTGAAGCCAGGCTA-3′和R-5′-AGCCTGTCTGTGGACGTGTCAT-3′）；Ifitm3（F-5′-TTCTGCTGCCTGGGCTTCATAG-3′和R-5′-ACCAAGGTGCTGATGTTCAGGC-3′）；Ifit1（F-5′-TACAGGCTGGAGTGTGCTGAGA-3′和R-5′-CTCCACTTTCAGAGCCTTCGCA-3′）；Ifit3（F-5′-GCTCAGGCTTACGTTGACAAGG-3′和R-5′-CTTTAGGCGTGTCCATCCTTCC-3′）；Ifngr2（F-5′-CCTTCCAGCAATGACCCAAGAC-3′和R-5′-TGTGATGTCCGTACAGTTCGGC-3′）；Ifit3（F-5′-GCTCAGGCTTACGTTGACAAGG-3′和R-5′-CTTTAGGCGTGTCCATCCTTCC-3′）；Irf1（F-5′-TCCAAGTCCAGCCGAGACTA-3′和R-5′-ACTGCTGTGGTCATCAGGTAGG-3′）；Irf7（F-5′-CCTCTGCTTTCTAGTGATGCCG-3′和R-5′-CGTAAACACGGTCTTGCTCCTG-3′）；Ido1（F-5′-GCAGACTGTGTCCTGGCAAACT-3′和R-5′-AGAGACGAGGAAGAAGCCCTTG-3′）；Icam1（F-5′-AAACCAGACCCTGGAACTGCAC-3′和R-5′-GCCTGGCATTTCAGAGTCTGCT-3′）；Bst2（F-5′-CAAACTCCTGCAACCTGACCGT-3′和R-5′-CTCCTGGTTCAGCTTCGTGACT-3′）；Mx1（F-5′-TGGACATTGCTACCACAGAGGC-3′和R-5′-TTGCCTTCAGCACCTCTGGCCA-3′）；Mx2（F-5′-ACCAGAGTGCAAGTGAGGAGCT-3′和R-5′-GTACTAGGGCAGTGATGTCCTG-3′）；Socs1（F-5′-AGTCGCCAACGGAACTGCTTCT-3′和R-5′-GTAGTGCTCCAGCAGCTCGAAA-3′）；H2-Ab1（F-5′-GTGTGCAGACACAACTACGAGG-3′和R-5′-CTGTCACTGAGCAGACCAGAGT-3′）；H2-K1（F-5′-GGCAATGAGCAGAGTTTCCGAG-3′和R-5′-CCACTTCACAGCCAGAGATCAC-3′）；H2-D1（F-5′-TGAGGAACCTGCTCGGCTACTA-3′和R-5′-GGTCTTCGTTCAGGGCGATGTA-3′）；H2-Dma（F-5′-GAGATTGACCGCTACACGGCAA-3′和R-5′-GAAGACAATGCCCATGATGGTGC-3′）；H2-Dmb1（F-5′-AGAGCCTTCTCCAGCGTTTGCA-3′和R-5′-TGTGGTTTGGGCTACTCGGACA-3′）；Pdl1（F-5′-TGCGGACTACAAGCGAATCACG-3′和R-5′-CTCAGCTTCTGGATAACCCTCG-3′）；Psmb9（F-5′-TACCGTGAGGACTTGTTAGCGC-3′和R-5′-GGCTGTCGAATTAGCATCCCTC-3′）；Fas（F-5′-CTGCGATTCTCCTGGCTGTGAA-3′和R-5′-CAACAACCATAGGCGATTTCTGG-3′）；Lgals3bp（F-5′-ATGCCTGTCGTCAGAGACTTCC-3′和R-5′-GGCAAAAAGCCGTCCACAGTAG-3′）；以及Gapdh（F-5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3′和R-5′-ATGCCAGTGAGCTTCCGGTTCAG-3′）。Fast SYBR Green Master Mix的循环条件为95°C 20秒，然后是40个循环，每个循环分别为95°C 为了将目标基因表达的循环条件标准化，我们以Gapdh为基准进行了调整。数据分析采用了比较循环阈值（ΔΔCt）方法。小鼠组织批量RNA测序及数据分析工作由Tulane大学转化研究与炎症中心NextGen测序核心团队完成。
批量RNA测序使用了Illumina TrueSeq Stranded Total RNA试剂盒制备cDNA文库，并在Illumina NextSeq 2000系统上进行测序。配对末端读段 align 到加州大学圣克鲁兹分校的Banana Slug Analytics平台。绝对log2 FC值大于0.2且调整后的P值小于0.05的基因被认为是差异表达基因（DEGs），随后使用这些基因作为输入，通过clusterProfiler（50）中的enrichGO工具进行GO生物过程过表达分析。
石蜡包埋的组织经福尔马林固定后切成5微米厚的切片。切片固定在带正电的玻璃载玻片上，用二甲苯脱蜡，并通过逐步稀释的乙醇系列重新水化至蒸馏水。抗原提取采用热诱导表位提取法。载玻片浸入柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，在EZ Retriever系统（BioGenex）中加热至99°C持续15分钟。内源性过氧化物酶用3% H2O2封闭5分钟，非特异性表位用1%牛血清白蛋白封闭15分钟。切片在4°C下过夜与抗胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）、PD-L1（Cell Signaling Technology）、CD117（Abcam）和CD63（Novus Biologicals）抗体孵育。IHC检测及苏木精复染使用SignalStain DAB底物试剂盒（Cell Signaling Technology）。染色后的切片通过数字病理切片扫描仪（Aperio CS2，Leica Biosystems）进行扫描和捕获。每个切片随机选择五个高倍视野计数阳性细胞。定量数据记录为每平方毫米组织面积内的平均阳性细胞数，作为每组的一个数据点，以便进行组间统计比较。
16S rRNA检测使用了RNAscope Red Assay试剂盒。石蜡包埋的5微米切片首先进行脱蜡，然后按照RNAscope 2.5 HD RED Assay（Advanced Cell Diagnostics, Inc.）的方法进行脱水处理。选择EB-16S-rRNA探针（ACDBio），并按照ACDBio协议进行染色步骤。定量数据记录为每平方毫米组织面积内的平均阳性16S焦点数，作为每组的一个数据点，以便进行组间统计比较。
大肠杆菌（E. coli）在Luria–Bertani培养基（Sigma-Aldrich，#L3522）中培养；B. fragilis在添加了5 mg/mL维生素K和5 mg/mL血红素的脑心浸液培养基中厌氧培养；P. gingivalis也在添加了5 mg/mL维生素K和5 mg/mL血红素的胰蛋白酶豆培养基中厌氧培养。这些细菌用于与KPC细胞系共培养，并使用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒（Invitrogen，#C34554）进行染色。
KPC细胞分别与P. gingivalis、E. coli和B. fragilis以1:20、1:50和1:100的不同浓度共培养4小时，培养基为添加了10% FBS的DMEM。培养结束后，含有细菌的细胞进行流式分选并送至scDNA测序。同时，也取样一部分细胞进行未分选的scRNA测序。
三个患者的原发性结直肠癌肿瘤被用于scDNA测序。新鲜组织样本先用胶原酶A处理3小时，再用胰蛋白酶处理生成单细胞悬液。细胞悬液用NucBlue（Invitrogen，目录号#R37605）和CD45-APC（BioLegend #368511）染色，并在冰上进行15分钟孵育。染色后的细胞使用BD FACSMelody进行流式分选，根据DNA含量和CD45表达情况分组到384孔板中。CD45?细胞通过Acoustic Cell Tagmentation协议（54）进行直接标记。具体步骤包括裂解细胞并使用Tn5转座酶插入双索引条形码接头，随后进行12到18轮PCR扩增。所得文库汇总后，在HiSeq 4000平台（Illumina）上进行50-bp单读取测序。
同样的三个原发性结直肠癌肿瘤也用于scRNA测序。新鲜组织样本采集后立即置于含10% FBS的DMEM中，温度控制在2°C至8°C。组织消化前用Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）冲洗并切成1至2毫米的片段。片段在1 mg/mL胶原酶IV（Thermo Fisher Scientific #17104019）中孵育30分钟，然后用含2% FBS的HBSS中和。通过70微米细胞滤网过滤后离心，无需分选直接进行测序。同时，为了监测组织样本的去污染过程，在整个测序过程中使用HT29细胞系（ATCC，#HTB-38）作为对照。细胞计数和活力检测使用Trypan blue方法，并通过Countess 3 FL自动化细胞计数器（Life Technologies）进行统计。细胞捕获和处理及基因表达文库制备按照10x Genomics的5′ scRNA测序指南进行。cDNA扩增和文库制备步骤后的质量控制（QC）通过Thermo Fisher Scientific的Qubit HS dsDNA Assay和Agilent HS DNA Bioanalyzer进行浓度和质量评估。文库合并前使用KAPA Biosystems的KAPA Library Quantification Kit进行浓度检测。合并后的文库使用NovaSeq 6000 S4-XP流式细胞仪进行测序，参数设置为读1 26轮、读2 90轮、索引1 10轮、索引2 10轮。原始测序数据（FASTQ文件）使用10x Genomics的Cell Ranger 7.1.0软件进行分析，生成包含质量控制和样本信息摘要的HTML网页。
scRNA测序数据预处理（解复用细胞条形码、读段对齐和生成基因计数矩阵）使用了10x Genomics提供的Cell Ranger Single Cell软件套件。人类scRNA测序数据的读段对齐使用了人类参考基因组GRCh38（hg38）。详细的质量控制指标被生成并评估，细胞经过严格筛选以获得高质量数据用于后续分析。基本质量过滤包括剔除复杂度低（检测到的转录本少于200个基因的细胞，如细胞碎片、空滴和低质量细胞）的细胞；检测到的基因少于3个细胞的细胞也被排除。此外，使用Seurat（v4.1.1）筛选出检测到的基因少于500个、读取次数少于500次或线粒体基因占比≥20%的细胞。
双细胞检测与去除及批效应校正：首先使用基于Python的Scrublet软件识别每个样本中的双细胞；其次根据簇分布和标记基因表达情况去除形成具有混合表达特征的簇；进一步审查每个识别簇中的表达水平和典型谱系相关标记基因的比例；然后使用Seurat进行数据标准化和缩放转换。使用Seurat的FindAllMarkers功能根据默认参数标识每个簇的代表性基因。
在scDNA/scRNA分析中，我们采用了标准的Kraken2方法，并进行了以下修改：首先使用FASTP进行修剪，随后使用Kraken2对小鼠基因组索引（参考基因组GRCm38；最小置信度0.03）进行第一次筛选；未分配给小鼠的读段再使用“Microbiome pipeline”中提到的标准TCGA Kraken2工作流程进行分析。HT29细胞系（n = 64,828细胞）作为背景对照组进行污染过滤。从scRNA测序中检测到的但在scDNA测序中未检测到的微生物被去除；然后手动审查剩余物种，并查阅文献以排除先前报道为结直肠癌或人类样本中污染物的微生物。在scDNA和scRNA中均检测到的前50种微生物被聚类、缩放并在R语言的pheatmap函数中可视化（见图3B）。结果显示这两种方法检测到的微生物具有相似模式。基因数据使用SCTtransform方法进行标准化，随后使用R语言的Seurat包进行降维和聚类。接着使用细胞条形码将基因数据与微生物数据进行匹配。
通过limma包（56）检测ITMB?和ITMB+之间的差异表达基因（DEGs）。调整后的P值小于0.05、绝对log2 FC值大于0.1且在每组至少10%细胞中表达的基因被定义为DEGs。完整的基因列表作为输入，使用clusterProfiler（50）进行GSEA分析。
数据以平均值±SEM表示，并使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software, Inc.）进行分析。除非另有说明，两组之间的统计显著性根据数据分布使用双尾学生t检验（参数学生t检验和非参数检验）。当比较两个以上的数据集时，分别使用单因素ANOVA（Fisher检验）和双因素ANOVA。*表示P < 0.05；**表示P < 0.01；***表示P < 0.001；****表示P < 0.0001。
原始TCGA肿瘤序列数据从https://gdc.cancer.gov获取。TCGA临床数据（包括生存估计和分期信息）可从GDC获取。RNA-seq数据已存入NCBI Gene Expression Omnibus（GEO），可通过GEO系列访问号GSE329919（隶属BioProject PRJNA1462212；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/1462212）获取。scRNA-seq数据已存入NCBI GEO，可通过GEO系列访问号GSE330797获取。
