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胃肠道作为人体最大的内部屏障表面，将免疫系统与肠道腔内容物分隔开来。除了管腔饮食抗原和环境毒素外，肠道内栖息着数以万亿计的共生微生物，包括细菌、病毒和真菌，这些微生物不仅有助于营养物质的生物利用度，也促进了针对肠道病原体的适当免疫应答的启动。与常规T细胞相比，表达γδ T细胞受体（TCR）的非传统T细胞与共生菌之间的关系研究相对较少。本综述将审视γδ T细胞在粘膜内的区室化分布、肠道微生物群对这些γδ T细胞群体及其功能的影响，并探讨在炎症性肠病（IBD）背景下这种相互作用是如何被破坏的。

肠道相关淋巴组织

肠道持续暴露于外部因素，包括共生和致病微生物；因此，必须维持精细的平衡，以确保清除入侵病原体的同时，限制对膳食抗原和肠道微生物群的免疫反应性。共生细菌在塑造肠道粘膜免疫中起着关键作用，既参与形成统称为肠道相关淋巴组织（GALT）的特殊结构，也参与建立对共生抗原的耐受性反应，从而防止异常的免疫激活。GALT包括肠系膜淋巴结（MLN）、派尔集合淋巴结（PP）、隐窝斑和孤立淋巴滤泡（ILF），这些是免疫诱导发生的部位。

大多数肠道免疫细胞分散在粘膜的两个区室之一：上皮层或下方的固有层（LP）。顾名思义，上皮内淋巴细胞（IEL）位于上皮的基底外侧部分以及相邻上皮细胞之间。IEL可根据其CD4和/或CD8共受体的表达分为两大类。诱导性IEL是表达αβ T细胞受体（TCRαβ）以及CD4或CD8αβ的常规抗原特异性T细胞。这些淋巴细胞响应外周遇到的抗原而归巢至肠道上皮。值得注意的是，一小部分LP CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）在上皮归巢后可获得CD8αα，从而发育成双阳性（DP）IEL。相比之下，天然IEL由表达CD8αα同源二聚体以及TCRγδ或TCRαβ的非传统T细胞组成，其激活以MHC非依赖的方式进行。天然IEL在IEL区室中占主导地位，在小鼠中，γδ T细胞约占IEL群体的近60%。而LP中的T细胞大多是常规CD4和CD8 T细胞，此处也发现少量γδ T细胞。

γδ T细胞的个体发育和归巢

γδ T细胞命运的确定和区室化始于发育早期。γδ T细胞的胸腺发育由强TCR信号诱导，而弱TCR信号则诱导TCRαβ发育。此外，γδ T细胞的发育在整个胚胎发生期直至出生后阶段以波次形式发生。在小鼠中，每一波次反映了由TCR的Vγ链定义的不同γδ T细胞亚群的发育。第一波由归巢至表皮的Vγ5 T细胞组成，随后是Vγ6和Vγ4 T细胞，它们迁移至次级淋巴器官和组织区室，包括肠道LP。Vγ7 T细胞随后出现在IEL区室，它们来源于胸腺或胸腺外部位。由于无胸腺裸鼠中也存在γδ IEL，因此认为这些非传统的IEL可以在隐窝斑中发育，并在迁移入上皮后接收成熟信号。最后，Vγ1和Vγ4 T细胞在出生后发育，主要存在于循环中，保留被招募至外周组织的能力。

TCR信号强度不仅对γδ T细胞谱系定型至关重要，也决定了其向效应细胞命运的定向。那些接收到强TCR信号的γδ T细胞发育成CD27⁺Tbet⁺产生IFNγ的γδ T细胞（γδ^IFN），而较弱的信号则导致CD27^?RORγt⁺IL-17a⁺γδ T细胞（γδ¹⁷）的分化。代谢编程在γδ T细胞效应亚群的分化中也扮演重要角色；强TCR信号导致糖酵解和线粒体膜电位下调，以促进γδ^IFN命运。相反，线粒体代谢和高脂质含量是γδ¹⁷定向的标志。效应细胞谱系也可通过细胞表面受体表达来定义，γδ^IFN细胞呈现CD27⁺CD45RB^hiCD44^intNK1.1⁺的表型，而γδ¹⁷细胞为CD27^negCD45RB^negCD44^hiCCR6⁺。

在肠道粘膜内，Vγ表达和效应功能在两个区室之间存在明显的分离。Vγ7 T细胞构成了γδ IEL的大部分，Vγ1和Vγ4 TCR表达较少，且均为γδ^IFN极化。相反，产生IL-17的Vγ6和Vγ4 T细胞在LP中占主导，同时存在少量产生IFNγ的Vγ1和Vγ4 T细胞。鉴于上皮和LP中γδ T细胞的Vγ链使用和细胞因子产生谱的分离，推测每个群体仍局限于其各自的区室。尽管IEL在最初向上皮运输时可能经过LP迁移，但很少有证据表明γδ IEL与γδ LPL自由交换，反之亦然。最后，对PP的分析显示，大多数γδ T细胞表达Vγ1Vδ6.3 TCR，Vγ4和Vγ6 T细胞占少数。

尽管存在区室化，影响γδ T细胞向肠道归巢的因素却惊人地相似。通过γδ T细胞表达的CCR9与其配体肠道上皮细胞产生的CCL25结合，发生化学趋化作用招募至肠道。CCR9的诱导也促进了其他肠道归巢标志物的表达，包括β₇整合素，它与α₄或α_E整合素形成异源二聚体。α₄β₇整合素与小肠和结肠LP内皮细胞表达的MAdCAM-1结合。一旦进入肠道，γδ LPL和γδ IEL随后下调α₄β₇整合素，而γδ IEL则上调α_Eβ₇（CD103），这是上皮E-钙粘蛋白的配体。

γδ T细胞在断奶前后植入IEL区室，其中大多数表达Vγ7 TCR。这些TCR具有高度多克隆性，但小鼠γδ IEL的配体尚未确定。Vγ7 IEL的选择和维持需要上皮细胞表达嗜乳脂蛋白样（BTNL）分子1和6。BTNL1缺陷小鼠无法建立Vγ7群体，但Vγ7 T细胞能够植入上皮，却在BTNL1诱导性缺失后无法扩增。值得注意的是，Vγ7 IEL可在无胸腺小鼠以及缺乏PP、外周淋巴结和MLN的小鼠中发育，这表明局部微环境对于塑造γδ IEL区室至关重要。上皮BTNL表达不依赖于膳食抗原或微生物群，但受上皮转录因子肝细胞核因子4（HNF4）α和γ的调控。HNF4家族成员在肠上皮中功能重叠，但HNF4α对结肠中BTNL表达的贡献更大，而HNF4γ调节其在小肠中的表达。虽然IEL区室中也发现Vγ1和Vγ4 T细胞，但这些亚群定型的机制尚未阐明。

与IEL相反，小鼠LP γδ¹⁷细胞专在胚胎胸腺中发育。γδ¹⁷细胞的胸腺发育发生在E15.5至E18.5天的时间窗口内，包括半恒定的Vγ6Vδ1、Vγ4以及程度较轻的Vγ1 T细胞。尽管发育时间窗短，但γδ¹⁷细胞寿命长且能够自我更新，因为γδ¹⁷细胞数量在围产期小鼠达到峰值。LP中还有一小部分γδ LPL保留产生IFNγ的能力。这些发现表明，γδ LPL区室的很大一部分是产前发育的，这与γδ¹⁷细胞的先天功能相符。

共生因子支持γδ IEL稳态和效应功能

γδ IEL区室的维持

虽然BTNL表达对于指定Vγ7 IEL至关重要，但IL-15信号是维持所有γδ IEL亚群所必需的。IL-15与IL-15Rα复合并运输至细胞表面，在那里以反式方式呈递给γδ IEL上表达的IL-2Rβ（CD122）。缺乏IL-15、IL-15Rα或IL-2Rβ的小鼠由于IEL增殖减少和细胞死亡增加而表现出γδ IEL数量减少。许多因素调节肠道粘膜中IL-15的表达。除了调节BTNL表达外，HNF4家族成员也诱导上皮Il15和Il15ra的表达。Toll样受体（TLR）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLR）信号可以分别诱导上皮细胞或抗原呈递细胞（APC）产生IL-15。虽然γδ IEL的TLR表达有限，但耗竭TLR2或其衔接蛋白MyD88会因上皮IL-15产生受损而导致小肠和结肠γδ IEL减少。此外，APC来源的NOD2缺失同样通过减少IL-15产生而损害小肠和结肠γδ IEL的维持。值得注意的是，补充NOD2配体胞壁酰二肽（MDP）可以在抗生素治疗后挽救γδ IEL群体。

除了微生物相关分子模式（MAMP）的先天免疫激活外，梭菌（Clostridium）、拟杆菌（Bacteroides）和乳杆菌（Lactobacillus）等共生菌产生色氨酸衍生代谢物，作为芳烃受体（AHR）的配体。AHR信号对于维持小肠γδ IEL至关重要，因为种系或淋巴细胞特异性删除AHR的小鼠中这些细胞显著减少，这表明需要细胞内在的AHR信号。虽然共生细菌的存在促进上皮AHR表达，但IEL AHR是否受到类似调节尚未确定。然而，AHR抑制因子（AHRR）（AHR的负调控因子）的表达可防止脂质过氧化和随后的IEL铁死亡。这些研究表明，AHR/AHRR信号必须受到严格调控以确保IEL稳态。

有目的地抑制γδ IEL效应功能

由于尚未开发出IEL特异性基因敲除小鼠，因此具体阐述γδ IEL的功能作用具有挑战性。相反，许多研究使用全局Tcrd基因敲除小鼠来探讨γδ T细胞对肠道生理的整体贡献，但许多过去的研究未能确定观察到的表型是源于γδ IEL还是LPL。如上所述，γδ IEL的激活可以以MHC非依赖的方式进行。γδ IEL表达自然杀伤（NK）受体，其中许多是抑制性的，而其他如NKG2D则与小鼠的上皮应激配体Rae-1和H60或人类的MICA和MICB结合。对应激肠细胞的感知促进了IEL介导的感染或受损细胞的细胞溶解。在稳态下，γδ IEL表达大量的丝氨酸蛋白酶颗粒酶（Gzm）A和GzmB，当它们与穿孔素一起在裂解囊泡中分泌时，会诱导细胞凋亡。虽然Gzm通常与穿孔素依赖的细胞死亡相关，但最近发现CD103与上皮E-钙粘蛋白的连接促进了γδ IEL细胞外释放GzmA和B，通过不依赖穿孔素的途径促进上皮细胞脱落至管腔。此外，IEL来源的GzmA在沙门氏菌（Salmonella）感染时促进上皮焦亡，而GzmB诱导上皮细胞凋亡。虽然IEL介导的细胞死亡增加有助于清除感染，但凋亡细胞释放的营养物质进一步促进了管腔内细菌的生长。

γδ IEL可以分泌IFNγ和TNF，以及参与促进T细胞、NK细胞和髓系细胞募集的趋化因子，包括XCL1、CCL3、CCL4和CCL5。尽管与促炎或细胞毒性特征相关，但γδ IEL在粘膜内被认为是保护性的。γδ IEL通过产生抗菌肽如RegIIIγ来防止共生和致病微生物的易位，这依赖于上皮MyD88信号。由于γδ IEL的模式识别受体（PRR）信号极少，值得注意的是，我们所知的关于共生菌/γδ IEL相互作用的大部分是通过肠上皮作为中介发生的。γδ IEL还可以通过TCR依赖和独立机制产生各种干扰素，突出了这些细胞连接先天和适应性免疫的能力。最后，γδ IEL分泌生长因子包括角质形成细胞生长因子（KGF），以在稳态和损伤响应中促进上皮增殖。

与外周T细胞或LP中的T细胞不同，IEL的独特之处在于它们表现出“激活但免疫学静止”的表型。在稳态下，IEL表达许多与T细胞激活相关的细胞表面标志物，包括CD44和CD69，这反映了这些哨兵细胞处于待命状态并准备响应感染或损伤的程度。虽然IEL的转录谱支持强烈的效应表型，但蛋白质组学研究表明γδ IEL的翻译能力降低。这是IEL细胞毒性效应功能受到限制以避免异常激活和潜在组织损伤的多种方式之一。支持这一点的是，γδ IEL对TCR激活的抵抗性显著高于常规T细胞；这可部分归因于TCR信号体若干组分的下调。此外，γδ IEL表达多种抑制性受体，如LAG3，以及CD8αα同源二聚体，当与上皮细胞上的胸腺白血病（TL）抗原结合时，会抑制IEL的激活和增殖。除了近端TCR信号事件的负调控外，IEL的代谢功能相对于其他T细胞群体显著受限。在一个上皮细胞不断受到管腔微生物信号冲击的微环境中，多种机制共同作用以抑制γδ IEL的效应反应，确保这些哨兵淋巴细胞能够对应激和其他损伤做出适当反应，同时限制其过度激活的潜力。

γδ IEL作为肠道边界巡逻队

先前的教条认为γδ IEL是不动的，提出了一个模型，即IEL迁移到上皮后嵌入在肠细胞之间。然而，活体成像显示γδ IEL沿着基底膜动态迁移，进出相邻上皮细胞之间的侧向细胞间隙（LIS）。因此，γδ IEL可以在短时间内与多个肠细胞相互作用，以提供上皮屏障的实时监视。这种运动性受IEL和上皮之间直接相互作用的调节，包括occludin（其表达是γδ IEL整体运动性所必需的）和CD103/E-钙粘蛋白的连接（调节γδ IEL在LIS中的停留时间）。CD103的缺失由于在上皮中的停留时间减少而增加了γδ IEL的速度。

尽管γδ IEL不断巡逻，但总体而言，γδ IEL优先定位于绒毛中部，它们要么向上迁移至绒毛顶端，要么向下迁移至隐窝顶部。然而，在无菌（GF）小鼠中，γδ IEL位于隐窝/绒毛轴的较低位置，整体运动性降低。类似地，在用广谱抗生素处理的常规小鼠中，γδ IEL的迁移速度和向LIS的迁移减少。分段丝状细菌（SFB）单定植后部分恢复了γδ IEL的监视行为，但同时定植普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）和粪肠球菌（E. faecalis）对IEL运动性没有影响。微生物群影响γδ IEL定位和迁移的确切机制尚未确定，但在GF小鼠和上皮MyD88诱导性缺失的小鼠中，γδ IEL的迁移动态同样受损。因此，上皮对共生细菌的识别似乎不仅影响γδ IEL的稳态，还影响它们监视屏障的能力。

虽然很明显γδ IEL响应共生菌的识别，但加入管腔病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）后，γδ IEL向上皮的迁移增强。γδ IEL向细菌邻近肠细胞的区域或感染的“热点”迁移，这与γδ IEL限制微生物穿过上皮易位的能力直接相关。抑制或增强通过破坏上述分子相互作用的γδ IEL监视分别导致易位事件的增加或减少。同样，上皮MyD88信号有助于沙门氏菌感染中这种迁移行为的改变。PRR诱导的IL-15可能也参与基础γδ IEL运动性，因为IL-15信号是PI3K介导的极性线索所必需的，这些线索是γδ IEL监视行为所需的。我们之前发现肠道粘膜内区室化的IL-15过表达直接影响γδ T细胞在上皮和LP中的定位。正如预期，上皮IL-15过表达促进了γδ IEL增殖并增强了γδ IEL运动性，而LP IL-15过表达导致γδ LPL扩增。阻断IL-2Rβ或将γδ T细胞从上皮中吸引到LP中导致病原体入侵增加。这些发现表明，将γδ IEL招募到细菌附着或入侵的部位可能对于γδ IEL靶向分泌抗菌因子以限制微生物渗透和随后的全身播散是必要的。

特定共生菌对γδ IEL生物学的影响

与常规T细胞群体不同，尚未有单一的共生菌种与特定的γδ IEL表型相关联。最近研究表明，一个多特异性TCRγδ识别含吲哚的生物分子，包括主要由梭菌属（Clostridium sporogenes）等物种产生的吲哚-3-丙酸（IPA）。尽管这种多特异性TCR在初始小鼠中仅由一小部分γδ IEL表达，但这一发现提出了一个问题：IPA介导的TCR或AHR激活是否也有助于γδ IEL稳态。

正如前面在上皮MyD88背景下提到的，间接的微生物感应支持各种IEL功能。用脆弱拟杆菌（B. fragilis）或多形拟杆菌（B. thetaiotamicron）定植GF小鼠，以MyD88依赖的方式招募产生IL-6的结肠IEL以促进屏障完整性，但这一反应有多少可归因于γδ IEL尚不清楚。我们实验室最近鉴定了一个独特的微生物群，它不仅促进γδ IEL区室的扩增，而且增加其监视行为以限制系统性沙门氏菌感染。这种过度增殖表型仅在小肠中观察到，并且与小肠管腔内容物中的7个扩增子序列变体（ASV）组成的菌群密切相关；其中4个最丰富的来自乳杆菌属（Lactobacillus），其余分别来自肠球菌属（Enterococcus）、粪杆菌属（Faecalibaculum）和Muribaculaceae科。我们最近报道，这种与γδ IEL过度增殖相关的微生物群通过TCR介导的IL-15信号诱导CD39的表达，CD39是一种有助于γδ IEL调节功能的胞外核苷酸酶。值得注意的是，在WT小鼠和表现出过度增殖表型的小鼠中，十二指肠粘膜IL-15和γδ IEL上CD39的表达水平最高，但管腔微生物群的组成在小肠各区域之间没有显著差异。广谱抗生素治疗消除了CD39的增加，但对γδ IEL数量或粘膜IL-15产生没有影响，这表明持续暴露于微生物群可能仅有助于观察到的表型的某些方面。消耗产生吲哚的革兰氏阳性菌对CD39的上调没有影响；因此，参与调节γδ IEL CD39表达的具体细菌或细菌衍生分子仍然未知。鉴于上皮细胞通常介导微生物群和γδ IEL之间的相互作用，确定微生物配体是直接激活TCR还是这种激活是间接的将是有意义的。由于抗生素消除了CD39的增加，但不影响γδ IEL增殖或迁移，因此这些共生菌也可能诱导长期表观遗传变化以影响γδ IEL稳态。

IEL在肠道分泌细胞生物学和微生物群调节中的作用

肠道微生物群和IEL区室之间的互惠关系对于宿主免疫激活和屏障防御至关重要。例如，γδ IEL直接和间接地有助于抗菌肽（AMP）的产生。在稳态下，病原菌跨屏障易位触发上皮MyD88信号，这是小肠γδ IEL产生RegIIIγ所必需的。相反，γδ IEL在结肠损伤时以MyD88非依赖的方式分泌RegIIIγ以及溶菌酶和补体蛋白。γδ IEL也影响潘氏细胞（Paneth cell）的生物学，潘氏细胞是负责AMP产生的主要上皮细胞类型。γδ IEL释放凋亡抑制因子5（API5）促进了缺乏克罗恩病（CD）易感基因ATG16L1的潘氏细胞的存活。此外，γδ IEL产生的IL-22被认为促进潘氏细胞表达血管生成素-4（Ang4）。缺乏γδ T细胞的小鼠表现出杯状细胞减少，导致整个肠道粘蛋白表达和糖基化降低。因此，这导致粘膜唾液酸减少，唾液酸是粘膜相关细菌生态位形成的关键营养来源。γδ IEL还分泌microRNA let-7F以增强特定细菌的定植，例如降解粘液的活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）。这些研究进一步强调了γδ IEL在调节粘膜内宿主-微生物反应中的多方面作用。

γδ LPL对肠道微生物提供早期反应

γδ LPL的维持和激活

与BTNL蛋白在塑造γδ IEL区室中的决定性贡献不同，没有特定的分子相互作用来确定LP内γδ T细胞亚群（Vγ1,4,6）的维持。一旦Vγ6和Vγ4 T细胞离开胚胎胸腺，STAT5是γδ¹⁷细胞在迁移到外周组织后存活和更新所必需的。有趣的是，回肠和近端结肠中的大多数Vγ6 LPL在进入肠道时共表达RORγt和Tbet。这些RORγt⁺Tbet⁺γδ LPL是多功能的，意味着它们可以产生Th1和Th17细胞因子。然而，在生命最初2天内，STAT5A信号的功能是诱导RORγt表达和随后的γδ¹⁷分化，并抑制与Th1信号相关的转录因子Tbet。STAT5在细胞因子受体信号下游被激活，包括IL-7，γδ LPL高表达其受体CD127（IL-7R）。除了STAT5，细胞凋亡抑制蛋白（cIAP）1/2在新生儿期后期至生命早期是维持γδ¹⁷细胞所必需的。cIAP1/2的缺失导致谱系转录因子cMAF和RORγt的表达减少，并损害γδ¹⁷细胞对细胞因子的增殖反应。抗生素治疗部分挽救了cIAP1/2表达缺失情况下γδ¹⁷LPL的损失，表明共生菌可能使本已脆弱的cIAP1/2缺陷型γδ¹⁷细胞承受压力。

在远端结肠，有一小群产生IL-17的CCR6⁺SCART2⁺Vγ4 T细胞。这些γδ¹⁷细胞主要在胚胎期发育，寿命长，更新率慢。虽然这些SCART2⁺γδ¹⁷细胞的功能贡献尚不清楚，但有可能这些细胞在ILF内局部分泌IL-17，或最终迁移并定居于LP。

虽然CD4 Th17细胞需要TCR刺激加上IL-23和IL-1来诱导IL-17，但γδ T细胞可以在没有TCR参与的情况下响应这些细胞因子产生IL-17。然而，缺乏IL-1R1的小鼠在外周显示γδ¹⁷细胞减少，表明细胞因子暴露对于效应反应至关重要。为此，表达IL-1R1的小肠γδ¹⁷LPL可能包含一群静止的先天效应细胞，可以响应APC的MAMP介导的激活而被IL-23和IL-1快速激活。因此，毫不奇怪，GF小鼠与SPF小鼠相比，表现出更少的激活的IL-1R1⁺γδ¹⁷LPL，这强调了共生菌定植对于IL-1R1⁺γδ LPL扩增是必需的。IL-1R1⁺γδ LPL的增殖及其产生IL-17的能力依赖于通过鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav1的TCR信号，表明微生物群刺激TCR以启动γδ¹⁷激活。

除了IL-1R1，最近一项研究表明，结肠CD44^hiγδ¹⁷细胞高表达PD-1，这与TCR信号或特定Vγ亚群没有直接关联。广谱抗生素治疗降低了PD-1表达。PD-1水平降低与内源性γδ¹⁷LPL中IL-17产生减少相关，但这些细胞在体外刺激下保留产生细胞因子的能力。相反，短期PD-1阻断增加了结肠γδ¹⁷效应细胞的数量。这些发现表明，共生菌上调γδ¹⁷细胞上的PD-1表达以调节体内产生的IL-17量。参与PD-1上调的共生因子尚不清楚，因为先前试图确定维持γδ¹⁷LPL群体所需的具体微生物的努力未能产生候选细菌。值得注意的是，新霉素或万古霉素治疗后IL-1R1⁺γδ¹⁷细胞的频率降低，但在接受甲硝唑的小鼠中没有观察到变化；这表明兼性革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物参与其中。这些发现共同表明，初始暴露于共生抗原可能激活TCR以驱动IL-1R1⁺γδ¹⁷LPL的扩增，并且随后由MAMP激活的APC产生IL-23和IL-1足以引发先天的γδ¹⁷反应，该反应通过PD-1表达受到调节。

虽然微生物群是小肠γδ LPL产生IL-17和IL-22的关键贡献者，但在盲肠和结肠中观察到相反的情况。这些发现表明，微生物群组成的差异可能影响γδ LPL效应功能的塑造。例如，在GF小鼠的盲肠中，γδ¹⁷LPL增加并产生更多IL-17，在广谱抗生素处理的SPF小鼠中也观察到这种表型。进一步研究发现，万古霉素处理对区域γδ¹⁷LPL群体产生相反的影响；革兰氏阳性菌是小肠中γδ¹⁷LPL所必需的，但在肠道更远端区域抑制这些细胞。

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