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综述：流感病毒对不同物种ANP32蛋白的适应差异与机制流感病毒RNA聚合酶与ANP32蛋白的跨物种博弈 引言 流感病毒的RNA聚合酶是一个由PB2、PB1和PA亚基组成的异源三聚体复合物。它与病毒的八个分节段基因组RNA结合，这些RNA被核蛋白（NP）包裹，形成病毒核糖核蛋白复合体——这是介导病毒基因组转录和复制的最小功能单元。调控此聚合酶活性的一个关键宿主因子是酸性核磷蛋白32 kDa（ANP32）家族。该家族包括ANP32A、ANP32B和ANP32E等多个成员，它们共享一个保守结构：一个N端的富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域和一个C端的低复杂度酸性区域（LCAR）。值得注意的是，ANP32A、ANP32B和ANP32E被特异性证实参与调节流感病毒RNA聚合酶的活性和宿主适应性。 ANP32A/B在流感病毒复制中的主要功能是催化病毒聚合酶从对称二聚体前体组装成不对称二聚体。这种不对称二聚体由一个负责合成RNA的复制酶（FluPolR）和一个伙伴聚合酶（包裹酶，FluPolE）组成，后者结合新合成的RNA并通过招募NP协助其包装成RNP。由此，ANP32A/B对于使病毒聚合酶能够合成互补RNA（cRNA）和基因组病毒RNA（vRNA）至关重要。 当禽流感病毒（AIV）跨越物种屏障感染哺乳动物宿主时，其生命周期的多个阶段会遇到物种特异性的限制。一个主要障碍是禽源病毒RNA聚合酶与哺乳动物ANP32蛋白之间的功能不相容性。禽类ANP32A和哺乳动物ANP32蛋白之间的物种特异性差异，对AIV在一个关键步骤——从cRNA合成vRNA的功能性FluPolR复合物（不对称二聚体）的组装——造成了特别严重的缺陷。在这种有缺陷的不对称二聚体中，FluPolE的RNA结合位点无法与FluPolR的产物出口通道正确对齐，导致vRNA的包裹和复制受损。vRNA产生的这个瓶颈构成了跨种传播的主要屏障，病毒必须通过适应性突变来克服它，才能在新宿主中建立感染。 流感病毒RNA聚合酶对不同物种ANP32蛋白的适应性 在禽类细胞中，ANP32A是ANP32家族中唯一能有效支持AIV RNA聚合酶活性的成员。含有N129I和D130N替换的禽类ANP32B不能支持病毒聚合酶；因此，基因敲除禽类ANP32A会废除病毒聚合酶功能并阻止基因组复制。与禽类ANP32A不同，哺乳动物直系同源物（如人、小鼠、猪、狗）在N端LRR和C端LCAR结构域之间缺少一个33个氨基酸的片段。这种较短的哺乳动物ANP32A形式无法支持禽流感聚合酶活性，从而构成了跨种传播的自然屏障。 为了克服这一初始屏障，AIV可以将宿主来源的禽类ANP32A包装进病毒颗粒中。在感染哺乳动物细胞时，这种共同递送的蛋白通过支持进入的禽源聚合酶暂时增强早期复制。虽然这种援助是短暂的——因为哺乳动物细胞缺乏用于子代病毒颗粒的禽类ANP32A——但增加的早期病毒载量关键地提高了产生哺乳动物适应性聚合酶突变（如PB2 E627K）的概率。一旦此类突变出现，聚合酶便转向利用宿主体内的哺乳动物ANP32蛋白，从而实现持续感染。 适应性通常涉及病毒聚合酶中的突变，使其能够与哺乳动物ANP32蛋白兼容。例如，PB2 E627K突变允许H5N1、H9N2和H7N9病毒的聚合酶利用人的ANP32A和ANP32B。在人类细胞中，单独敲除ANP32A或ANP32B不会损害人类适应病毒的聚合酶活性；需要双重敲除才能废除活性，表明ANP32A和ANP32B在支持聚合酶功能上存在冗余。值得注意的是，携带PB2 E627K的聚合酶对人ANP32B的适应性要强于对ANP32A的适应性。有趣的是，人类适应的IAV聚合酶仍然可以使用鸡ANP32A，但不能使用含有N129I和D130N替换的ANP32B。 在小鼠中，携带PB2 E627K的禽类病毒的聚合酶仅依赖ANP32B，因为鼠ANP32A在第130位存在残基变异，阻碍了功能性支持。除了E627K，其他PB2突变如Q591S、D701N和T473M也在如2009年大流行H1N1、H3N2、H7N9和H9N2等多种病毒背景下促进了对哺乳动物ANP32的适应。 猪由于其呼吸道同时存在禽类和人类型唾液酸受体，以及猪ANP32A的独特特征，被认为是流感病毒的“混合容器”。猪ANP32A中第106位和第156位的氨基酸替换能够微弱地支持禽类病毒聚合酶活性。2009年大流行H1N1毒株使用PB2 Q591R和D701N突变来适应猪ANP32A/B，并且优先使用ANP32A而非ANP32B。类似地，H3N2犬流感病毒（CIV）通过PB2 D701N适应犬ANP32A，尽管携带此突变的毒株仍然相对少见。值得注意的是，最近发现的PB2-M631L突变已成为H5N1病毒适应牛宿主的标志，该突变在结构上与残基591和627聚集，以调节与ANP32的相互作用。 最近发现，携带PB2-627V的禽类病毒能够有效利用禽类和人的ANP32A，在鸡和小鼠中支持强劲复制。这些病毒表现出双重特征：禽类特征（在PB2第627位拥有典型的E残基）和哺乳类特征（功能上类似于PB2 E627K突变）。PB2-627V在多个亚型中的出现可能构成公共卫生风险。 在正常情况下，ANP32E不支持流感聚合酶活性。然而，在人类ANP32A/B敲除细胞中连续传代甲型流感病毒A/Turkey/05/2009 (H1N1) (Tky05)筛选出了PB1 K577E和PA Q556R突变，使其能够利用ANP32E。类似地，在ANP32A敲除的鸡细胞中传代H5病毒产生了能够进行ANP32A非依赖性复制的突变病毒，这些病毒携带哺乳动物适应性突变，如PB2 D256G、PA T97I，或包含PB2 E627K与PA K339M和M561V的组合。虽然机制尚不清楚，但这些突变可能促进与其他ANP32家族蛋白的补偿性相互作用。 虽然培育ANP32A编辑的鸡作为遏制禽流感的策略显示出前景，但高剂量H5病毒攻击可能导致突破性感染。这是通过适应性聚合酶突变介导的，例如PA-E349K和PB2-M631L，这些突变使病毒能够利用原本支持性较弱的鸡/人ANP32B或ANP32E蛋白进行复制。这种可塑性凸显了流感病毒在选择压力下利用替代性ANP32蛋白的显著适应能力。值得注意的是，促进病毒在ANP32A编辑鸡中适应的PB2-M631L突变，也出现在最近影响美国奶牛的H5N1毒株中，作为对新宿主的关键适应。长期使用此类家禽需要仔细评估潜在的进化风险，包括新毒株的出现和传播性增强。 一些AIV通过非聚合酶病毒蛋白增强哺乳动物适应性。NS2（NEP）蛋白通过一个SUMO相互作用基序结合SUMO修饰的人ANP32A/B，加强ANP32A/B与vRNP的相互作用并提升聚合酶活性，从而促进对人类宿主的适应。此外，ANP32蛋白通过LCAR结构域直接与NP相互作用，促进NP招募到复制复合体，并推动新合成RNA包装进子代RNP。 此外，ANP32A的物种特异性差异不仅限制IAVs的禽到人传播，也限制人流感B病毒（IBV）聚合酶在禽类细胞中的活性。有趣的是，IBV聚合酶能够使用鼠ANP32A，而后者无法恢复IAV聚合酶活性。 总体而言，流感病毒采用多样的关键突变来适应不同物种的ANP32蛋白，并在宿主体内对ANP32家族成员表现出不同的偏好，这显著增加了控制跨种传播的难度。 流感病毒RNA聚合酶对同一物种内ANP32A剪接变体的差异适应性 单个物种内表达多种ANP32A的替代剪接变体。由于其氨基酸序列的差异，这些变体在调节AIV RNA聚合酶活性方面表现出不同的能力，从而直接影响病毒在宿主体内的复制效率。 在禽类物种中，已鉴定出鸡ANP32A的三个主要转录变体——命名为ANP32A-X1 (ANP32A333)、ANP32A-X2 (ANP32A299)和ANP32A-X3——它们在支持流感病毒，特别是AIVs的复制能力上存在显著差异。与ANP32A-X1相比，ANP32A-X2亚型缺少四个关键的氨基酸残基（VYSE，残基129–132），显著削弱了其支持携带禽类特征性PB2-627E的病毒聚合酶活性的能力。ANP32A-X3与哺乳动物ANP32A序列同源性更高，无法支持AIV RNA聚合酶功能。进一步分析表明，ANP32A-X1是鸡和鸭细胞中最丰富的功能变体。这种分布关键地影响了禽类细胞对AIV感染的固有易感性。然而，某些禽类物种中ANP32A剪接变体的表达模式偏斜——表现为ANP32A-X1水平较低（如燕子、喜鹊）和ANP32A-X3水平升高（如鹅、天鹅）——可能促进哺乳动物适应性流感病毒的选择和持续存在。 值得注意的是，剪接调节因子SRSF10促进鸡ANP32A的替代剪接，将表达从33-aa形式（ANP32A-X1）转变为29-aa变体（ANP32A-X2）。这种转变与直接抑制AIV聚合酶活性相关。通过减少功能性ANP32A-X1的丰度，SRSF10介导的剪接调节代表了一种新的宿主机制，通过调节ANP32A亚型表达来平衡病毒复制。 类似地，马ANP32A（eqANP32A）经历替代剪接，产生六个有文献记载的、表达水平各不相同的变体。这些亚型对马流感病毒的RNA聚合酶活性支持程度不同。其中，eqANP32A_X2不仅是表达量最高的，也是支持聚合酶功能最有效的。这些发现表明，细胞内特定ANP32剪接变体的相对丰度可以调节其对流感病毒的易感性。因此，研究调控ANP32替代剪接的机制可能为控制和预防流感病毒感染产生新的策略和治疗靶点。 ANP32调节流感病毒RNA聚合酶活性及宿主适应性的机制 ANP32与流感病毒RNA聚合酶的相互作用 ANP32蛋白与流感病毒RNA聚合酶之间的相互作用对于聚合酶活性至关重要。ANP32A/B中的L128、N129和D130残基直接参与结合病毒聚合酶。与这些残基相互作用的聚合酶位点（如PA K413、PA D529和PB2 T609）发生突变会损害ANP32A-聚合酶相互作用并减少RNA合成。将D149Y和D152H突变引入鸡或人ANP32A也会减少与聚合酶的结合，抑制聚合酶活性和病毒复制。 猪ANP32A含有I106V和P156S替换，增强了其与禽流感聚合酶的结合，并促进了病毒在猪体内的复制。鸡ANP32A含有一个哺乳动物直系同源物中所没有的33-aa插入片段，这加强了其与禽源（PB2-627E）和人类适应（PB2-627K）聚合酶的相互作用。然而，它对禽病毒聚合酶活性的增强程度远大于对哺乳动物适应聚合酶的增强程度，表明33-aa片段的影响超出了单纯的结合，对聚合酶功能有更深层次的调节。这些表明聚合酶–ANP32相互作用是必要的，但对最佳活性而言并非充分条件。 PB2 E627K突变使禽源聚合酶能够利用人ANP32蛋白，其中带正电荷的赖氨酸与人ANP32A/B酸性环中的E151形成关键的盐桥。早期研究认为这并非由于与人ANP32A的结合增强，但最近使用灵敏技术的研究揭示，人ANP32A通过其C端LCAR与PB2-627K发生多个低亲和力相互作用，而这些相互作用与禽适应的627E则较弱且较少。PB2 Q591R替换的功能与E627K类似，通过与ANP32的E151残基形成盐桥，从而在缺乏E627K的情况下支持病毒在人类细胞中的强劲复制。 PB2的NLS结构域和627结构域之间的界面是宿主ANP32 LCAR结构域的结合界面。PB2 D701N突变用一个中性天冬酰胺（N）替换了701位带负电荷的天冬氨酸（D）。这改变了NLS结构域的静电表面，使其更有利于结合带负电、带负电荷的人ANP32 LCAR。在2009年大流行期间，D701N和Q591R协同作用，优化了聚合酶复合物，以实现与猪ANP32的高亲和力相互作用。类似地，在犬H3N2流感中，PB2 D701N突变微调了聚合酶，使其能有效结合犬ANP32A，促进了病毒在犬类中的持续传播。在最近的牛H5N1疫情中发现的PB2 M631L突变位于627结构域内，邻近627位。它直接微调了PB2 627结构域与ANP32 LCAR之间的结合界面，从而促进了病毒在哺乳动物宿主中的适应。此外，在人类ANP32A/B受限的情况下，PA Q556R突变可以通过加强与哺乳动物ANP32E蛋白的相互作用来支持强劲的聚合酶活性，从而增强病毒复制。总之，这些突变展示了一种多方面的策略，即ANP32的直接结合（通过E151和LCAR）与聚合酶稳定性和寡聚化的变构调节协同作用，以实现宿主适应。 在IBV中，ANP32A的物种特异性差异限制了人类毒株在禽类细胞中的相互作用和聚合酶活性。 ANP32调节病毒复制并对cRNA-to-vRNA合成施加哺乳动物限制 流感病毒聚合酶转录病毒mRNA并复制基因组RNA。复制分两步进行：vRNA-to-cRNA和cRNA-to-vRNA合成。在哺乳动物宿主中，ANP32A和ANP32B特异性支持适应性病毒聚合酶的这两个复制步骤，但不影响转录。相比之下，禽类ANP32A支持禽类病毒的完整复制周期（两个步骤）。 与禽类ANP32A结构不同的哺乳动物ANP32蛋白限制了禽流感聚合酶的活性。因此，禽类病毒可以利用人ANP32A/B进行cRNA合成，但不能用于vRNA生产；这种损伤特异性地发生在cRNA-to-vRNA合成步骤。因此，ANP32A的物种特异性差异调控着流感基因组复制过程中的cRNA-to-vRNA合成步骤。此外，在ANP32A/B敲除细胞中，PB1 K577E和PA Q556R突变允许病毒聚合酶利用ANP32E，增强vRNA合成。 ANP32介导病毒聚合酶的不对称二聚化 IAV、IBV和流感C病毒聚合酶与ANP32蛋白复合物的冷冻电镜结构表明，ANP32A促进了一个不对称二聚体的组装——该二聚体由一个FluPolR和一个FluPolE组成——这对于病毒基因组复制至关重要，尽管不同病毒类型之间存在显著的结构差异。在流感C病毒中，ANP32A稳定FluPolR并诱导FluPolE发生构象变化，将PB2的C端结构域（包括PB2-627和PB2-NLS结构域）重新定向朝向PA（P3）亚基的C端。在IAV中，H5N1聚合酶与人ANP32B结合的结构揭示了一个类似的不对称二聚体，其中FluPolE的PB2-Mid-link和PB2-CBD结构域与FluPolR的PB2-N2结构域相互作用。这种重新定向使FluPolE的RNA结合位点与FluPolR的产物出口通道对齐，从而实现协调的复制和包裹。 与结合流感C病毒FluPolE和FluPolR的ANP32A不同，IAV中的ANP32B特异性仅与FluPolE相互作用。这种结合由ANP32B的C端LRR区域介导，并涉及与PB2 627结构域的直接接触。作为静电伴侣，宿主因子ANP32结合并稳定游离的、未结合的病毒聚合酶（apo-聚合酶），促进聚合酶二聚体的形成。这个ANP32稳定的二聚体的一个亚基随后被递送给一个RNP相关的复制酶，以组装功能性的不对称复制二聚体。 然而，最近的结构研究揭示了这一过程在不同流感类型之间的关键功能差异。在IBV中，ANP32直接预形成并稳定对称apo-聚合酶二聚体内部的FluPolE构象。与此形成鲜明对比的是，对于IAV，虽然ANP32结合并溶解apo-聚合酶，但复合物仍处于过渡状态。稳定的、成熟的FluPolE结构只有在被递送给RNP相关的复制酶时才能实现，并在最终的不对称复制复合物中被协同定义。因此，ANP32对FluB充当预形成伴侣，但对FluA主要充当护送和桥接因子。 在缺乏ANP32A和ANP32B的情况下，病毒聚合酶组装成对称二聚体。这种有缺陷的结构破坏了FluPolE的RNA结合位点与FluPolR的产物出口通道之间的正确对齐，而这对于RNA保护和后续包裹至关重要。虽然这些对称二聚体保留了一些基础的复制活性，但与ANP32稳定的不对称二聚体相比，它们在功能上并非最优。然而，补偿性突变如PB1 K577E和PA Q556R通过招募ANP32E促进不对称二聚化，从而在ANP32A/B敲除细胞中恢复病毒复制。PB1 K577E突变通过削弱对称二聚体（FluPolA）界面发挥作用。相反，FluPolE中的PA Q556R突变通过形成一个与E154的盐桥来促进不对称二聚体的形成，E154是ANP32A、B和E蛋白中保守的残基。 当流感病毒在编辑过的、无功能的ANP32A的转基因鸡或鸡胚中复制时，病毒群体以PA E349K和PB2 M631L突变为主，这些突变使其能够利用鸡和人的ANP32B和ANP32E。PA E349K突变通过将聚合酶的寡聚平衡向复制能力强的不对称二聚体转移而间接起作用，而PB2 M631L突变可能增强了FluPolE与次优ANP32蛋白（ANP32B和ANP32E）的相互作用，进一步促进聚合酶不对称二聚体的形成，从而促进复制。总的来说，破坏对称二聚体界面的突变与增强ANP32结合的突变协同作用，促进不对称二聚体的形成，并恢复流感病毒RNA聚合酶的活性。结构数据还表明，FluPolR的核酸内切酶活性位点被遮蔽，这与其无法执行转录功能一致。 PB2-627的酸碱特性及对ANP32的适应性 在不对称聚合酶二聚体中，ANP32的酸性LCAR结构域（ANP32ALCAR）插入两个聚合酶亚基的PB2-627结构域之间。人ANP32ALCAR仅含有带负电荷的酸性残基，有利于与PB2-627位点的碱性（如带正电荷的赖氨酸，K）或中性（如不带电荷的缬氨酸，V）残基相互作用。相比之下，鸡ANP32ALCAR包含一个额外的33-aa片段，富含酸性和碱性残基，使其能够支持在PB2-627位点具有酸性（E）、碱性（K）或中性（V）残基的聚合酶。627位的中性缬氨酸赋予了与禽类和人类ANP32蛋白的兼容性。 ANP32蛋白作为静电伴侣，通过长程吸引力（例如，非特异性静电相互作用）被招募到病毒聚合酶，随后ANP32–PB2界面精确的酸碱互补性稳定了不对称二聚体并增强了聚合酶活性。这些表明具有精确静电兼容性的聚合酶–ANP32相互作用对于最佳活性至关重要。 展望 虽然本综述聚焦于AIVs通过ANP32蛋白对哺乳动物宿主的适应，但研究流感病毒在其他已建立的哺乳动物宿主中的进化对于全面了解大流行风险至关重要。一个关键的例子是H3N2 CIV。自出现以来，H3N2 CIV在犬类中传播期间积累了适应人类的突变，导致其在人类细胞中的聚合酶活性增强。PB1 D154G突变是CIV中人类适应的一个关键标志，这与在H5N1和H7N9等禽源病毒中发现的突变不同。PB1 D154G或其他突变是否介导对人类ANP32蛋白的适应，以及它对人类跨种感染构成何种风险，仍然是悬而未决的问题。 最近H5N1溢出到奶牛和其他哺乳动物（如农场猫）中，加上其在泌乳山羊中的高传播性，强调了通过ANP32等宿主因子研究流感病毒适应的紧迫性。对新兴宿主中病毒适应的持续监测和机制研究对于评估公共卫生风险和实施精准控制措施至关重要。 流感病毒适应不同物种ANP32蛋白的机制似乎是保守的：ANP32结合促进不对称二聚体形成并促进cRNA-to-vRNA复制。然而，病毒采用不同的突变来适应不同的哺乳动物ANP32蛋白，并在宿主体内对ANP32家族成员表现出明显的偏好。这些偏好的结构基础仍不清楚。此外，适应一种哺乳动物的病毒感染其他物种的潜力需要进一步评估。未来研究利用人工智能分析突变聚合酶与ANP32蛋白之间的结构相互作用，可能揭示为何在不同宿主中需要不同的突变、是否发生功能收敛，以及适应一种宿主如何影响与其他物种ANP32蛋白的兼容性。这些见解将为设计广谱抗病毒药物提供信息，并改进对病毒进化和跨种传播风险的预测。 |
