功能性人基本成纤维细胞生长因子2在大肠杆菌中的超表达

Tamilvendan Manavalan | Jiawu Bi | Khongsay Naulchan | Nguyen Thi Bich Van | Xin Yi Chua | Ryan Yow | Sook Yee Lee | Lamony Jian Ming Chew | Christoph Ottenheim | Shigeki Sugii | Manikandan Lakshmanan | Weibiao Zhou | Prakash Arumugam | Fong Tian Wong | Melanie Weingarten | Ee Lui Ang

新加坡食品与生物技术创新研究所（SIFBI），隶属于科学、技术及研究局（A*STAR），地址：31 Biopolis Way, Nanos, 新加坡 138669

摘要

人类基本成纤维细胞生长因子2（hbFGF2）是一种高度保守的蛋白质，对细胞增殖、分化和迁移至关重要。商业化的hbFGF2价格昂贵，显著增加了培养肉（CM）培养基的成本，从而影响了生产过程的可扩展性。本研究旨在通过从大肠杆菌T7 Express中高效纯化活性hbFGF2来降低培养基成本。一种经过密码子优化的hbFGF2变体（hbFGF2-G3）被克隆到pET-28a(+)质粒中，并在大肠杆菌T7 Express中表达。在摇瓶和批次生物反应器中优化了培养参数（包括温度和诱导时间）。在20°C的摇瓶培养条件下，产量达到1.3 g/L；而在批次生物反应器中，产量高达2.95 g/L，该结果使用自制的纯化hbFGF2-G3作为标准进行密度测定。随后通过His-trap亲和层析和尺寸排阻层析对蛋白质进行了纯化。通过HepG2细胞系的FGF/FGFR激活实验和Ph9F-1x鱼细胞系的细胞增殖研究验证了纯化hbFGF2-G3的生物学活性。我们的研究结果表明了一种经济高效的活性hbFGF2-G3生产方法，这对培养肉生产的经济效益具有重要意义。

引言

全球对肉类的需求持续增长，预计到2030年将达到3.73亿吨[1]。与2018-2020年的平均水平相比，增长了14%，主要原因是全球人口的增长和家庭收入的提高，这些因素促进了肉类消费的增加[1]。这种需求的激增给传统的畜牧业带来了巨大压力，而畜牧业是温室气体排放、森林砍伐和土地退化的主要来源[2][3]。培养肉（CM）通过在受控环境中直接从动物细胞生产肉类，提供了一种有前景的替代方案[4][5][6]。这种方法有望提高食品安全性，大幅减少环境足迹，并通过消除屠宰需求和最小化污染风险来改善动物福利[7][8][9]。尽管在成本、可扩展性和消费者接受度方面仍存在挑战，但培养肉在可持续满足全球不断增长的肉类需求方面具有巨大潜力[10][11]。

培养肉生产的主要成本因素是依赖无血清培养基（SFM），其中添加了昂贵的促细胞生长因子[12][13]。特别是成纤维细胞生长因子-2（FGF2）和转化生长因子β1（TGF-β1）对于刺激细胞增殖和分化至关重要，但它们占总培养基成本的95%以上[12][13][14]。虽然这两种因子价格昂贵，但天然FGF2在室温下的半衰期不到10小时[15][16][17]，这种不稳定性要求频繁补充培养基，给培养肉的生产在储存、分配和整体经济效益方面带来了重大挑战。

为了解决这些问题，有必要利用人类基本成纤维细胞生长因子（hbFGF）家族中更稳定的变体。这个高度保守的超家族包含22个成员，它们能够启动细胞内信号级联反应，调节细胞生长、分化、胚胎发育、血管生成、组织修复和再生等关键功能[14][18][19]。其中，FGF2因其能够刺激细胞增殖并保持细胞多能性而被广泛用于培养肉培养基中，从而实现商业可行性[12][20][21]。最近开发的一种耐热变体hbFGF2-G3在室温下的保质期超过7天，有可能克服野生型FGF2相关的物流瓶颈[17]。

利用微生物重组技术生产这类生长因子为培养肉提供了经济高效且可扩展的解决方案[22]。然而，仍需解决一些问题，例如确保适当的翻译后修饰（如糖基化）、二硫键的形成以实现正确的蛋白质折叠，以及足够的蛋白质溶解度以获得生物活性构象[23][24][25]。从细菌表达系统中纯化的蛋白质往往没有活性，因此可能需要表达后进行“重折叠”以获得活性蛋白质。或者，也可以使用哺乳动物细胞表达系统来生产活性纯化蛋白质[26][27]。这两种方法成本都很高，显著增加了培养肉所需的培养基成本[28][29]。尽管存在这些困难，大肠杆菌表达系统具有多个优势，如生物反应器中的快速培养速度、遗传操作便利性和较低的培养基成本[30][31]。更重要的是，它提供了多种溶解标签，可以改善蛋白质表达并简化下游处理流程（DSP），使其成为重组蛋白生产的潜在宿主[31][32][33]。尽管这些标签通常需要在纯化后进行切割以防止构象干扰[16][34][35]，但总体效率和成本效益使得大肠杆菌成为工业规模生产的高竞争力宿主。

本研究的主要目标是建立一种优化且可扩展的生产平台，利用大肠杆菌生产耐热的hbFGF2-G3变体。为了降低DSP成本，本研究采用了无连接子和融合标签的设计；hbFGF2-G3基因被设计为包含N端和C端的6×His标签，然后克隆到pET-28a(+)表达载体中。接下来，本研究重点优化了该重组蛋白在摇瓶和生物反应器系统中的表达条件，并通过亲和层析和尺寸排阻层析（SEC）进行纯化。最后，在HepG2和Ph9F-1x鱼细胞系中评估了所得hbFGF2-G3蛋白的生物学活性，以证明其作为培养肉生产中经济高效生长因子的潜力。

化学物质和底物

Phanta聚合酶和克隆酶试剂盒购自中国南京的Vazyme公司。OneShot?大肠杆菌TOP10菌株、预染蛋白梯度、蛋白染色溶液和商业FGF2标准品（cFGF2）购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司。异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）和咪唑（ImH）购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。蛋白质纯化使用HisPrep? FF 20 mL柱和HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱进行。

温度对摇瓶发酵中hbFGF2-G3生产的影响

为了优化重组hbFGF2-G3的表达，我们在不同温度（15°C、20°C、25°C和30°C）下监测了30小时培养期间的生物量和蛋白质产量（见图1）。最高生物量生长出现在30°C，其次是25°C、20°C和15°C。通过Western blot的密度测定分析（补充图1A）显示，30°C培养6小时后hbFGF2-G3的表达量最高，为0.31 g/L。

结论

本研究成功优化了hbFGF2-G3的生产，确定20°C为摇瓶发酵的最佳温度，产量为1.33 g/L。批次发酵进一步实现了高达2.95 g/L的显著高产量，远超以往报道的浓度。通过实现这一前所未有的产量并展示了一种简化、无融合标签和连接子的纯化过程，本研究为培养肉生产的成本效益提供了重要的技术进步。