肺炎克雷伯菌感染下小鼠细胞外囊泡的感染专属蛋白质组揭示免疫应答特征

细胞外囊泡（EVs）是一种由细胞释放的脂质双分子层小结构，在细胞间通讯和宿主感染应答中扮演关键角色。本研究旨在探索利用源自感染小鼠血浆的EVs蛋白质组作为细菌感染生物标志物的可行性。

为了明确肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）感染与生理状态之间EVs产生的差异，研究人员使用Zetasizer Nano ZS测量了EVs的大小分布、数量和直径。分析显示，未感染样品的颗粒大小分布范围为50.8至458.7纳米，而感染样品的范围则为32.7至458.7纳米。三个生物学重复的颗粒大小分布曲线下面积测量值未显示显著差异。对样品中颗粒直径的评估显示，未感染样品的平均直径为180.9 ± 9.0纳米，而感染样品为165.5 ± 22.4纳米，这些数值并无显著不同。随后对每份样品的颗粒数量进行量化，也未观察到样品间的显著差异。最后，通过蛋白质印迹法验证了从EVs中检测到补体成分C4b，以确认从小鼠血浆中成功分离出EVs。总之，对颗粒大小、直径和数量的评估表明，这些表型特征在感染状态下得以维持。

鉴于EVs大小、直径和数量的相似性，研究团队进一步在蛋白质水平探索分子差异。他们通过基于质谱的蛋白质组学分析，对从肺炎克雷伯菌感染或未感染小鼠血浆中分离的EVs进行了分析。在所有样品中共定量了78种宿主蛋白，其中35种宿主蛋白在两种条件下均被识别，构成了核心蛋白质组。对核心蛋白质组的主成分分析显示，样品能够根据感染状态进行分离。基于欧几里得距离进行层次聚类的热图也表明，核心蛋白质组的丰度谱会根据宿主的感染状态发生改变。考虑到与EVs的已知关联及其在细胞稳态和抗菌宿主防御中的作用，研究人员对包括纤维蛋白原（即Fga, Fgb, Fgg）在内的急性期蛋白进行了更深入的研究，并观察到在肺炎克雷伯菌感染宿主状态下，EVs来源的这些蛋白质丰度显著增加了2.6倍（p= 0.016）。在核心蛋白质组中还识别了其他免疫相关蛋白，包括载脂蛋白、免疫球蛋白、血红蛋白、糖蛋白和血清转铁蛋白，这些发现支持了在感染条件下检测到免疫系统成分，且其丰度在感染后有所升高。

除了核心蛋白质组，研究人员还识别了43种仅存在于肺炎克雷伯菌感染小鼠血浆来源EVs中的宿主蛋白。为了确认EVs，他们通过基因本体细胞组分（GOCC）对这些蛋白质进行了评估，发现超过77%的感染专属蛋白与细胞外膜相关，包括血液微粒、细胞外区域、细胞外空间和膜结合结构，而只有不到7%与细胞质相关。接下来，根据基因本体生物过程（GOBP）进行评估，发现超过50%的感染专属蛋白与免疫应答激活和急性炎症反应有关，约14%与稳态相关，约10%与运输和信号传导相关。利用STRING数据库对这43种感染专属宿主蛋白构建的相互作用网络，基于马尔可夫聚类算法（MCL）定义了五个蛋白质簇：19个与急性期和止血相关的蛋白（红色簇），6个与T细胞分化和细胞因子产生相关的蛋白（黄色簇），4个与补体激活相关的蛋白（绿色簇），以及4个与运输和分子伴侣相关的蛋白（青色和蓝色簇）。最后，通过Reactome数据库进行通路富集分析，定义了在感染专属EV蛋白质组中富集的七条通路，其中最为显著的是通过清道夫受体结合和摄取配体以及血小板脱颗粒。

这项研究探讨了肺炎克雷伯菌感染小鼠血浆来源EVs的表型特征和蛋白质组谱，旨在评估利用EVs分离作为此类感染诊断策略的可行性。在分析中，尺寸排阻色谱（SEC）成功地将EVs与血浆中的其他成分分离，并支持了对EVs大小、直径和数量的深入分析；每个参数在未感染和感染状态下都保持一致。结合蛋白质组分析，研究人员探索了核心蛋白质组（即在两种感染状态下均识别到的蛋白）和感染专属蛋白质组（即仅在感染状态下识别到的蛋白）的组成。这些发现突显了感染后免疫系统的激活，并定义了细菌感染特有的EV特征。这些发现支持了利用EVs进行诊断的潜力，但由于仅检测到宿主蛋白而未识别出细菌蛋白，以及识别出的蛋白数量有限，这在临床上作为诊断工具的可行性受到限制。其他局限性还包括蛋白质鉴定仪器的灵敏度，以及使用小鼠模型进行EV收集限制了样品体积，可能导致识别出的EV特征是小鼠对肺炎克雷伯菌应答特有的，而在人体系统中可能出现不同的特征。

EVs通常根据大小分为三类：外泌体（直径30–100纳米）、微囊泡（直径100–1000纳米）和凋亡小体（直径1–5微米）。每类EVs都具有特定的蛋白质标志物。基于SEC和检测到的EVs大小，研究人员预期所收集的组分包含了外泌体和微囊泡；他们的蛋白质组学结果也支持了外泌体的分离，例如识别到了Gapdh和Actb。需要承认的是，该方法限制了通过视觉确认和评估所收集及分馏样品中EVs的结构和纯度。尽管可以将EVs大小与外泌体特性相关联，但未来使用电子显微镜成像的方法将能提供更高的材料纯度信心。研究人员还观察到在感染状态下总颗粒数有非显著性的增加，这一发现与其他研究有所不同。例如，一项研究调查了与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染超过60天相关的小鼠EVs，发现血清中的外泌体浓度在感染后急剧增加，并与细菌载量相关。该研究还表明，在细菌感染期间，EVs的释放速率可能随时间增加，并且可能存在病原体特异性的EV调节。因此，增加可用的小鼠心脏血浆样本数量，可能会提高样品间的蛋白质鉴定数量，并在更长的监测周期内识别出仅在感染特定时间点产生的蛋白或丰度在整个感染过程中发生变化的蛋白，这些都可能影响研究结果。

本研究的一个局限是通过SEC从肺炎克雷伯菌感染小鼠血浆中分离EVs所鉴定出的蛋白数量有限。其他EVs分离方法，如差异超速离心、密度梯度离心或免疫亲和法，可能会增加蛋白质鉴定数量。此外，增加样本量和可收集的血浆体积，和/或转向体外细胞系培养模型，也可能提高EVs的回收率和可检测蛋白的数量。另外，研究未在EVs蛋白质组中识别出细菌蛋白，这表明尽管肺炎克雷伯菌会产生EVs，但本方法主要分离了宿主来源的EVs用于后续分析。理想情况下，对于临床诊断应用，该方法应能识别出包裹有细菌蛋白的宿主EVs或宿主与细菌共同来源的EVs，以支持确认感染并对感染病原体进行分类。另一个需要考虑的点是在核心EVs蛋白质组中检测到了几种载脂蛋白，包括Apob, Apoe, Apoa2, Apoc1, Apoa1和Apoc4。载脂蛋白是高密度脂蛋白的组成部分，这些脂蛋白颗粒在体内循环。SEC的一个局限是难以分离尺寸范围相同的非EV分子和颗粒，最常见的是脂蛋白，其直径在30至80纳米之间。在蛋白质组学分析中识别出载脂蛋白可能会影响有关颗粒大小分布和每个条件下颗粒丰度的结果。尽管蛋白质鉴定率相对较低且难以区分EVs与脂蛋白，研究人员仍然观察到了符合EVs研究最低信息要求的特征性标志物，例如在EVs蛋白质组分析中检测到了Actb, ApoB, Gapdh, Thbs1和Fn1。

研究还检测到了细菌感染后宿主免疫应答的预期激活。例如，EVs参与免疫应答可能促进跨通路的通讯，如血液凝固、炎症反应和抗菌体液应答。作为对严重感染的反应，急性和全身性炎症与血液凝固相关，这在肺炎克雷伯菌感染模型中通过识别炎症和凝血相关蛋白（如结合珠蛋白和抗凝血酶-III）得到支持。结合珠蛋白是一种急性期反应物和炎症标志物，在感染状态下可能升高，并且通过EVs在血细胞间的细胞内通讯，可以运输促凝血蛋白从而诱导血液凝固。

EVs在免疫应答中的作用不容小觑，涉及细胞内通讯，以及免疫体液应答的激活和增殖、血液凝固和补体级联反应。在感染专属数据集中识别出的一个主要蛋白质组与小鼠免疫球蛋白相关，属于GOBP的免疫应答类别。之前的一项研究也报告了EVs与免疫球蛋白的结合。免疫球蛋白参与体液或抗体介导的免疫应答，这是适应性免疫系统的一个分支，能识别并结合病原体相关抗原，以激活经典补体级联并促进病原体的中和。抗原加工导致主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的呈递，而β-2-微球蛋白作为MHC I类的重要组成部分，在感染专属蛋白质组中被识别。在呈递与外来抗原结合的MHC I类分子后，抗原呈递细胞可能会释放也含有MHC I类分子的EVs，以协助细胞内通讯。免疫球蛋白-抗原复合物参与补体系统也具有重要意义，因为它涉及经典途径，该途径在与补体因子C1q结合后，切割C4和C2以形成C3转化酶。值得注意的是，研究者在感染专属蛋白质组中观察到了C4的裂解产物C4b，以及具有识别和切割C4功能的甘露糖结合凝集素蛋白（Mbl1）和甘露糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶（Masp1），以及C4b结合蛋白C4bpa。鉴于在感染专属蛋白质组中识别到C4b，并且已知C4在对肺炎克雷伯菌产生免疫应答和限制严重细菌感染中的作用，研究人员选择通过蛋白质印迹法验证C4b的产生；另一种方法可以是验证其他在感染和未感染条件下均检测到丰度的免疫相关蛋白，例如C3。然而，验证性蛋白质印迹在两种感染状态的样品中均检测到了C4b。这些发现表明C4b存在于核心EVs蛋白质组中，尽管在未感染样品来源的EVs中丰度较低，这与经典途径在细胞稳态中的多种作用相一致。此外，这些数据支持EVs在激活和递送参与凝集素补体级联的补体成分以识别感染部位肺炎克雷伯菌成分方面的作用。总之，本研究定义了在肺炎克雷伯菌感染期间，小鼠血浆来源EVs的共同和独特特性，这些特性支持了免疫应答的激活以及具有诊断潜力的感染期间蛋白质产生的特征。

总而言之，这些发现揭示了肺炎克雷伯菌感染驱动了宿主EVs景观的显著分子重编程，即使在没有囊泡大小或丰度发生重大表型变化的情况下。通过定义核心和感染专属的EVs蛋白质组，本研究揭示了独特的蛋白质特征，其中纤维蛋白原和免疫相关因子的显著升高能够区分感染与未感染状态。这些数据为理解细菌感染期间EVs介导的宿主应答提供了新见解，并强调了EVs来源蛋白质作为感染动态敏感指示剂的诊断潜力。