摘要
活细菌疗法在肿瘤治疗中具有巨大潜力，因为它能够靶向肿瘤并激活免疫系统。然而，其临床转化面临重大挑战，包括有限的抗癌效果和细菌残留带来的安全风险。为了解决这些问题，我们开发了一种自限性的、光激活的生物杂交系统OTTQ-Cl@HEcN。该系统由益生菌埃希菌Nissle 1917（EcN）与耐缺氧的I型光敏剂OTTQ-Cl通过基因工程HaloTag偶联策略共价连接而成。在光照作用下，OTTQ-Cl@HEcN产生局部活性氧（ROS），同时杀死肿瘤细胞和细菌。这种内置的细菌自我清除机制确保了有效的肿瘤清除，并最大限度地减少了全身暴露。在多种肿瘤模型中，OTTQ-Cl@HEcN引发了强烈的局部和全身抗癌免疫反应，表现为树突状细胞（DCs）的成熟、T细胞活性的增强以及长期免疫记忆的形成，从而防止了肿瘤复发和转移。OTTQ-Cl@HEcN的关键特性包括其对肿瘤的精确靶向性、耐缺氧性、强烈的免疫激活能力和内在的安全性，共同实现了可控且有效的抗癌效果。
引言
活细菌疗法已成为癌症治疗的新一代有吸引力的平台。这些系统独特地利用了某些菌株的肿瘤趋向性和强大的免疫刺激性，而这些特性使用合成材料难以复制(1), (2), (3), (4)。埃希菌Nissle 1917（EcN）是一种非致病性的益生菌。由于其遗传稳定性和缺乏毒力因子，EcN已安全地应用于人类健康领域超过一个世纪(5)。此外，EcN优先定植于实体肿瘤的缺氧和免疫抑制核心区域，这些区域通常无法被传统疗法和免疫效应细胞到达(6), (7)。一旦在肿瘤微环境（TME）中定植，这些细菌会释放病原体相关分子模式（PAMPs），如脂多糖，激活先天免疫传感器，促进DCs的成熟和抗原呈递(8)，这使得细菌成为增强抗肿瘤免疫反应的理想载体(9)。尽管前景广阔，但两大主要障碍严重阻碍了其临床应用。首先，大多数益生菌或共生菌株缺乏足够的内在杀菌活性，使其无法单独作为治疗方法。其次，也是最关键的，不受控制的细菌增殖会带来显著的安全风险，包括全身性炎症、细胞因子风暴和败血症(10), (11)。因此，精确控制细菌至关重要。为了解决这一问题，研究人员开始将细菌疗法与外部刺激结合，以实现按需激活和精准控制(12), (13), (14), (15)。其中，光是实现这种控制的理想工具，提供了无与伦比的时空精确性。光动力疗法（PDT）在这方面特别有吸引力，它利用光在特定位置激活PSs生成ROS(16), (17), (18), (19)，从而实现按需肿瘤消融，弥补了天然细菌的弱内在活性。此外，这种产生ROS的能力还可以作为诱导细菌清除的机制，降低安全风险。重要的是，PDT还能诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放损伤相关分子模式（DAMPs），增强全身抗癌免疫(20), (21)。然而，一个重大挑战是大多数传统II型PSs依赖氧气才能发挥作用，在肿瘤缺氧核心区域（细菌优选的生长环境）效率较低(22), (23), (24), (25)。相比之下，I型PSs通过电子或氢原子转移生成羟基自由基（•OH）和超氧阴离子（•O2-），即使在缺氧条件下也能保持强烈的ROS生成能力(26), (27), (28)，这使得它们非常适合在细菌TME环境中使用。另一个技术挑战是将PSs稳定地整合到细菌表面。传统方法如简单吸附往往导致负载效率低、结合不稳定和脱靶效应(29), (30)。我们通过使用HaloTag系统克服了这一问题，HaloTag是一种广泛用于蛋白质特异性共价修饰的人工工程蛋白标签(31), (32)。在细菌表面工程化表达HaloTag为创建稳定、高效且可控的药物递送平台提供了理想基础。在这里，我们介绍了OTTQ-Cl@HEcN，这是一种生物工程细菌平台，它通过HaloTag系统将耐缺氧的I型PS OTTQ-Cl与益生菌EcN表面共价连接（图1）。具体而言，基于供体–π–受体（D–π–A）分子工程策略，设计了不同类型的ROS生成偏好PSs。在筛选了它们的ROS生成量和抗菌活性后，OTTQ因其强大的ROS生成能力和优异的杀菌能力而被选为功能分子。随后，OTTQ进一步修改了卤素标签连接位点，生成OTTQ-Cl并连接到细菌表面（OTTQ-Cl@HEcN）。当该平台定植肿瘤并受到光照激活时，生成的ROS会同时杀死肿瘤细胞并导致细菌自我毁灭。这种集成机制提供了一种独特的安全且可控的方法，确保治疗后的生物安全性。我们的系统因此结合了肿瘤靶向性、耐缺氧性光毒性和内置的自限机制。通过多种小鼠模型实验，OTTQ-Cl@HEcN有效抑制了原发性和转移性肿瘤，并建立了强大且持久的全身免疫反应，防止了肿瘤复发。我们的发现为微生物免疫疗法提供了一种模块化、设计安全的策略，结合了精确递送、响应性激活和可控清除。
节摘
PSs的设计、光物理特性和光动力活性
D–π–A分子工程策略通过空间分离最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）分布，有效减小了单重态-三重态能量差（ΔEST），从而提高了系统间交叉（ISC）效率并促进了ROS生成(33)。引入含有丰富孤对电子的杂原子进一步增加了ISC概率(34)。基于这些原理，我们合成了一系列D–π–A PSs结论
在这项研究中，我们开发了一种共价工程化的、自限性的活生物杂交平台OTTQ-Cl@HEcN，解决了活细菌癌症治疗的关键限制。与传统依赖被动封装或短暂代谢标记的细菌-光敏剂系统不同，我们的平台整合了三项关键创新：(i)稳定的共价HaloTag锚定，防止货物泄漏并确保精确的时空控制；(ii)耐缺氧的I型
