丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)复合体在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)毒力中作用的研究

细菌病原体必须具备精细的生理适应机制以适应其感染微环境。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)所栖息的宿主细胞胞质是一个具有高进入屏障、代谢受限且存在免疫监视的区室。此前，研究人员通过转座子突变筛选鉴定出因关键代谢通路（包括细胞壁生物合成、甲基萘醌合成及丙酮酸代谢）被破坏而导致胞内生存缺陷的突变株。本研究证明，丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)复合体的突变尽管在营养丰富的培养基中仍能保持旺盛生长与存活，但在感染过程中表现出显著的生存缺陷。对PDH E2亚基(pdhC)突变株的代谢组学分析显示其呼吸-发酵(respiro-fermentative)代谢发生改变：上游糖酵解中间产物和三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环中间体水平降低，同时伴有丙酮酸和乳酸的积累。此外，研究人员发现PDH突变株无法有效利用磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)碳源，但在非PTS碳源（如己糖磷酸）上的生长与野生型无差异。抑制子筛选鉴定出5个能在PTS底物果糖上恢复生长的抑制子突变株，每个均含有氧化还原感应调节因子(rex)基因上的独立突变。PDH突变株中Rex功能的缺失可部分恢复胞内生长，但无法恢复体内毒力。综上，这些发现表明PDH是单核细胞增生李斯特菌在宿主胞质内导入和代谢PTS依赖碳源所必需的，并提示PDH依赖的氧化还原平衡及呼吸-发酵代谢最终有助于胞内适应性与毒力。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰阳性胞内食源性病原体，可侵入宿主细胞并在细胞胞质中生存与复制，其经典毒力因子（如LLO、ActA、PrfA）已有详尽研究，但支持其在限制性胞质微环境中存活与致病的代谢基因及通路尚不清楚。前期正向遗传筛选发现丙酮酸代谢相关基因突变导致胞内巨噬细胞清除，其中丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)复合体突变株在富营养体外培养基中生长正常，却在胞内及小鼠感染模型中完全减毒，提示PDH对胞质生存特异重要。PDH位于糖酵解与三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环交汇点，催化不可逆将丙酮酸转化为乙酰辅酶A(acetyl-CoA)、生成NADH，并受能荷及NAD⁺/NADH比调控；同时菌体能通过磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)摄取宿主碳源（该过程消耗磷酸烯醇式丙酮酸phosphoenolpyruvate, PEP生成丙酮酸）。为何PDH缺失不影响体外生长却严重损害胞内毒力，及其与碳源摄取、氧化还原平衡的关系尚未阐明。本研究旨在解析PDH复合体各亚基缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力表型的影响，探究PDH缺陷导致的代谢扰动、PTS碳源利用障碍及氧化还原感应调节因子Rex(redox-sensing transcriptional regulator)的调控作用，明确PDH在胞内感染中的生理意义。

采用单核细胞增生李斯特菌10403s野生型(WT)及pdhA::Tn、pdhC::Tn、pdhD::Tn转座子突变株和pdhC回补株为研究对象；通过乙基甲磺酸(ethyl methanesulfonate, EMS)诱变结合果糖限定培养基进行抑制子筛选，全基因组测序鉴定抑制突变；进行富培养基及限定化学合成培养基(Listeria synthetic medium, LSM)加不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露糖、己糖磷酸+还原型谷胱甘肽）的生长曲线测定；高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)检测培养上清乙酸与乳酸分泌；非靶向液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)代谢组学分析胞内代谢物；体外原代小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)感染测定胞内复制能力；L2成纤维细胞空斑试验评估细胞间扩散；C57BL/6小鼠尾静脉注射急性感染模型测定脾脏与肝脏荷菌量。

研究人员检测了pdhA::Tn、pdhC::Tn、pdhD::Tn突变株在脑心浸液(brain heart infusion, BHI)中的生长曲线、BMDMs胞内生长、L2成纤维细胞空斑形成及小鼠脏器荷菌量。结果显示各PDH亚基突变株在BHI中生长与WT无异，但在巨噬细胞中无法生长并被清除，空斑面积减小约50%–70%，小鼠脾脏和肝脏荷菌量降至检测限以下，且表型可被pdhC回补株挽救。表明任一PDH亚基缺失均导致复合体功能丧失，引起同等程度的胞内生存与体内毒力缺陷，后续以pdhC::Tn为代表进行机制研究。

研究人员将WT与pdhC::Tn过夜培养于BHI，HPLC检测上清发酵产物。WT以产乙酸为主、乳酸较少；pdhC::Tn突变株乳酸显著升高、乙酸降低，代谢向发酵偏移（虽不如甲基萘醌缺失株显著），回补后恢复正常。说明PDH缺失破坏呼吸-发酵平衡，碳流不能有效进入TCA循环供呼吸链，促使更多丙酮酸转向乳酸发酵。

为验证毒力缺陷是否源于NAD⁺再生障碍（类似于甲基萘醌缺失株可被水形成型NADH氧化酶(NADH oxidase, NOX)回补），研究人员在pdhC::Tn中异源表达NOX。结果显示NOX过表达未能恢复空斑形成，仅轻微提升乙酸产量，远不及在甲基萘醌突变株中的挽救效果。表明pdhC::Tn的毒力缺陷不能单纯用氧化还原失衡解释，涉及PDH特有的其他代谢缺陷。

研究人员将WT与pdhC::Tn于含110 mM葡萄糖的LSM中培养至对数中期，进行非靶向代谢组学。发现pdhC::Tn胞内丙酮酸与乳酸积累，TCA循环中间体普遍耗竭，但上游糖酵解中间体（葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸等）也显著低于WT（与预期上游堆积相反）。提示除PDH阻断致下游乙酰-CoA与TCA中间体缺乏、丙酮酸堆积外，还存在碳源摄取或上游通量减弱的问题。

基于代谢组提示碳源摄取缺陷及PTS依赖PEP→丙酮酸转化受阻（pdhC::Tn中丙酮酸堆积可能反馈抑制PTS磷酸中继），研究人员在LSM中以不同碳源测试生长。pdhC::Tn在PTS依赖碳源（葡萄糖、果糖、甘露糖）上生长严重迟缓，而在非PTS碳源己糖磷酸（需诱导UhpT表达，加10 mM还原型谷胱甘肽）上与WT相当，且PTS缺陷可被pdhC回补恢复。证实PDH缺失特异性损害PTS介导碳源的利用，而对非PTS碳源利用无影响。

为探明PTS利用障碍的可逆性及体内毒力关联，研究人员用EMS诱变pdhC::Tn后涂布LSM+55 mM果糖平板筛选抑制子，对5个保留转座子且恢复果糖利用的克隆全基因组测序，均检出氧化还原感应转录调节因子rex(LMRG_01223)上的独立突变——3个DNA结合域错义突变、1个无义突变（Arg51终止）、1个C端大片段缺失，均为rex功能缺失型。表明rex失活可解除对发酵途径的阻遏从而恢复PDH缺陷株PTS碳源利用。

研究人员用AlphaFold3预测单核细胞增生李斯特菌Rex同源二聚体与NAD⁺及DNA复合物结构，将抑制突变定位其上。所有错义突变位于DNA结合域α螺旋（1–4），无突变位于NAD⁺/NADH结合口袋，说明抑制机制为损害DNA结合导致Rex去阻遏，而非影响辅因子感知。

液体LSM+果糖培养验证，5个rex抑制子突变株生长速率与终点OD₆₀₀均与WT相当，确认rex失活可在液固两相恢复pdhC::Tn对PTS碳源的利用能力。

研究人员比较有氧与厌氧（GasPak厌氧罐）条件下各菌株在LSM+果糖中的终端生长。有氧时pdhC::Tn生长差，WT、pdhC回补株及rex抑制子（Rex Arg51-STOP）生长良好；厌氧时包括pdhC::Tn在内的所有菌株均达相似OD。说明Rex通常在具呼吸链的有氧/高NAD⁺条件下阻遏发酵基因；PDH缺陷致NAD⁺/NADH失衡使Rex持续阻遏发酵从而抑制PTS运转；厌氧条件天然解除Rex阻遏，或rex基因失活同样解除阻遏，允许PDH缺陷菌通过发酵（产乳酸再氧化NADH）维持PEP循环及糖摄取。

BMDMs感染实验显示rex抑制子使pdhC::Tn部分恢复胞内复制（介于WT与pdhC::Tn之间）。但小鼠静脉感染模型中，rex抑制子并未挽救体内毒力，脾肝荷菌量与pdhC::Tn无差异，均远低于检测限，而WT达~10⁷CFU/器官。提示恢复PTS碳源利用仅部分克服胞内巨噬细胞代谢压力，PDH缺失引起的乙酰-CoA匮乏、TCA中间体耗竭及其他体内宿主免疫/代谢严苛微环境仍限制系统性感染建立。

研究人员讨论指出，PDH复合体各亚基缺失均致相同胞内与体内毒力衰减表型，pdhC::Tn代谢向乳酸发酵偏移但NOX无法回补，区别于呼吸缺陷株。代谢组揭示pdhC::Tn丙酮酸/乳酸堆积、TCA中间体枯竭及上游糖酵解中间体降低，后者归因于PTS碳源摄取受损——PDH缺失使丙酮酸堆积抑制PTS磷酸中继（PEP→丙酮酸受阻），且Rex感知低NAD⁺/NADH比阻遏发酵基因进一步限制糖摄取；rex功能缺失或厌氧条件解除此阻遏恢复PTS利用及部分胞内生长。抑制子筛选锁定rex为关键调控节点，Rex通过感知NAD⁺/NADH比在具呼吸能力时阻遏发酵，间接影响PTS活性。rex抑制子部分挽救巨噬细胞内生长却未恢复体内毒力，说明PDH除支持PTS碳源导入外，其产生乙酰-CoA供脂肪酸合成、填充TCA循环、维持氧化还原与呼吸-发酵平衡对完整毒力不可或缺，体内宿主环境较体外巨噬细胞模型代谢与免疫压力更为严格。研究提出模型：PDH依赖的丙酮酸→乙酰-CoA通量支撑TCA循环与高NAD⁺/NADH比，促进Rex介导发酵阻遏及有氧呼吸偏好；PDH破坏致氧化还原失衡与Rex持续阻遏PTS运转，限制胞内碳源获取；Rex失活或厌氧解阻遏可使菌经发酵产乳酸再生NAD⁺维持PEP循环与糖酵解通量，条件允许pdhC::Tn在体外及部分胞内环境下生长，但因PDH本身功能未恢复无法完全补偿体内毒力。该研究阐明PDH是连接碳代谢、氧化还原感应(Rex)与PTS碳源利用的核心节点，为单核细胞增生李斯特菌胞内代谢适应及潜在抗代谢靶点提供依据。论文发表于《Infection and Immunity》。