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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)基因组在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中的克隆为探究丝状支原体属（Mycoplasma）基因组在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中的克隆可行性，研究人员将大小为约1 Mb的鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）S6株全基因组克隆至酿酒酵母细胞中。研究人员构建了含合成酿酒酵母复制元件（酵母着丝粒质粒元件，包括CEN4和ARS1）及选择标记基因（URA3）的转座子载体（YCpTn4），将其随机插入鸡毒支原体基因组。随后采用两种方法将整合有酵母复制子的鸡毒支原体基因组导入酵母细胞：（1）用低熔点琼脂糖胶块包埋并分离完整鸡毒支原体基因组DNA（gDNA），经β-琼脂糖酶消化后通过聚乙二醇（PEG）诱导转化酵母原生质体（spheroplast）；（2）PEG诱导鸡毒支原体完整细胞与酵母原生质体直接融合。两种方法均获得了携带克隆鸡毒支原体基因组的酿酒酵母菌株，并经纳米孔测序（nanopore sequencing）验证。 本文对发表于《Molecular Biology》的研究论文《Cloning of Mycoplasma gallisepticum Genome in Saccharomyces cerevisiae Cells》进行解读总结。 研究背景与立题依据 合成生物学技术的发展使病毒、细菌及真核生物基因组的化学全合成成为可能，而大片段DNA在宿主细胞中的自主复制与维持是合成基因组技术的关键环节。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，简称酵母）因其强大的同源重组系统及可维持大DNA分子作为酵母着丝粒质粒（yeast centromeric plasmid, YCp）的特性，成为大片段DNA克隆的首选宿主。目前已成功将生殖器支原体（M. genitalium，0.58 Mb）、肺炎支原体（M. pneumoniae，0.82 Mb）、丝状支原体（M. mycoides，1.1 Mb）、无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii，1.5 Mb）等软壁菌门（Mollicutes）成员的全基因组克隆入酵母细胞，但鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）S6株（约1 Mb）尚未见报道。部分支原体基因组因含对酵母具毒性的表面核酸酶基因而影响克隆，故在开展合成基因组工作前需验证目标基因组能否在酵母中稳定复制且无毒性。鸡毒支原体是重要禽类病原体，属肺炎支原体系统发育组，其全基因组在酵母中的克隆可为后续合成支原体基因组构建、基因编辑及最小细胞研究提供平台。 主要关键技术方法 研究人员以鸡毒支原体S6野生株和酿酒酵母BY4742株（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）为材料，构建含酵母CEN4-ARS1复制子、URA3选择标记及Tn4001转座酶/四环素抗性（tetM）选择标记的转座子载体YCpTn4，电转化鸡毒支原体获得随机插入酵母复制子的转化子混合池；采用两种策略将改造后支原体基因组转入酵母：（1）低熔点琼脂糖胶块包埋法制备完整基因组DNA，β-agarase I消化后PEG诱导酵母原生质体转化（genome–spheroplast法）；（2）经氯霉素处理及冻融循环的鸡毒支原体完整细胞与酵母原生质体PEG诱导融合（cell–spheroplast法）；转化子于CM-URA（缺尿嘧啶合成培养基）上筛选，PCR引针对每100 kb设计扩增子验证基因组完整性，阳性克隆提取总DNA进行Oxford Nanopore Technologies（ONT）纳米孔测序验证。 RESULTS AND DISCUSSION Construction of M. gallisepticum Strains with Inserts of Yeast Chromosome Elements（构建含酵母染色体元件插入的鸡毒支原体菌株） 研究人员将源自YCpLac35载体的CEN4-ARS1-URA3酵母复制选择模块通过Tn4001转座子插入鸡毒支原体S6基因组，构建YCpTn4转座载体并电转化支原体，获得含随机单拷贝转poson插入的四环素抗性转化子混合池。先以热休克法验证环状转poson载体可在ura3Δ酵母中复制产菌落，确认酵母模块功能正常。混合池中不同插入位点可规避可能不利插入导致的克隆效率下降，为后续转移提供材料。 Transfer of M. gallisepticum Genome into S. cerevisiae Spheroplasts（鸡毒支原体基因组导入酿酒酵母原生质体） 优化zymolyase处理条件使pRS426质粒转化效率达约1000菌落/μg DNA。分别用genome–spheroplast法（胶块包埋DNA经β-agarase释放后转化原生质体，约10 μg gDNA获单菌落）和cell–spheroplast法（经至少三次冻融循环的支原体细胞与原生质体PEG融合获单菌落）进行转移。对照实验显示常规CTAB法提取的片段化DNA无法产生酵母转化子，说明需相对完整的基因组DNA方可在酵母中行使功能。最终genome–spheroplast法获10个转化子、cell–spheroplast法获20个转化子，经三轮CM-URA平板复筛得9个稳定转化子。 含克隆鸡毒支原体基因组的酵母菌落生长速率低于空载或小块插入载体转化子（5天 vs 2天达可见大小），提示支原体基因组可能对酵母具轻微毒性或YCp复制速率偏低致URA3补偿跟不上正常细胞周期。 PCR检测每100 kb间隔引物对5个候选克隆进行完整性筛查，5个克隆全基因组扩增阳性（2株来自genome–spheroplast法，3株来自cell–spheroplast法）。纳米孔测序平均覆盖度约20×，比对显示克隆基因组无大片段缺失或移码，与参考株差异主要为vlhA基因启动子区三核苷酸重复变异（鸡毒支原体常见现象）、同聚区长度变异及SNP，且差异在各克隆中可重现，源于原始支原体群体动态及克隆选择而非DNA转移过程引入的新突变；各克隆中转座子插入位点不同，可供后续定点操作参考。证明两种导入方法及YCpTn4载体均适用于约1 Mb鸡毒支原体基因组在酵母中的稳定维持。 讨论与结论翻译总结 研究表明，含CEN4-ARS1复制子及URA3标记的转座子载体可高效将酵母复制选择元件随机单拷贝插入鸡毒支原体S6基因组，经PEG诱导酵母原生质体转化完整胶块包埋基因组DNA或PEG诱导支原体细胞与酵母原生质体融合均可获得稳定携带完整约1 Mb鸡毒支原体基因组的酿酒酵母菌株，纳米孔测序证实克隆基因组完整且无大片段重排或编码区丢失。鸡毒支原体S6基因组在酵母中可稳定复制，未表现出致死性毒性，适合作为后续合成支原体基因组组装与编辑的酵母平台。该研究拓展了可在酵母中全基因组克隆的Mollicutes类群，为禽源支原体合成生物学及最小细胞研究奠定基础。 |
