牛鼻支原体日本分离株抗菌药物低敏相关基因及突变的鉴定及用于抗菌药物敏感性判别遗传学方法的建立

摘要：牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis，即Mycoplasmopsis bovirhinis）是一种感染牛呼吸道的共生菌，是犊牛肺炎发生的危险因素。本研究旨在通过基因组学分析表现抗菌药物低敏感性的分离株，鉴定与氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、林可酰胺类及氟喹诺酮类抗菌药物敏感性降低相关的基因和突变，并建立可直接检测这些遗传学决定因子的简便、快速药敏判定遗传学方法。结果显示，研究人员在噬菌体相关区域鉴定到编码同源基因的区段——即氨基糖苷类6-腺苷酰转移酶［aminoglycoside 6-adenylyltransferase，ANT(6)，aadE基因］、氨基糖苷类3′-磷酸转移酶［aminoglycoside 3′-phosphotransferase，APH(3′)-IIIa，aphA-3基因］，以及四环素核糖体保护蛋白（tetracycline ribosomal protection protein，Rpp，rpp基因），它们分别与氨基糖苷类和四环素类敏感性降低有关。此外，研究人员在23S rRNA基因（rrl）、DNA旋转酶A亚基基因（gyrA）、DNA拓扑异构酶IV C亚基基因（parC）及其同源基因（parC′）中鉴定到与大环内酯类、林可酰胺类和氟喹诺酮类敏感性降低相关的点突变。携带上述决定因子和突变的田间分离株自2001年以来在日本被广泛检出。这些基因和突变可通过靶区域PCR扩增、DNA测序及杂交探针熔解曲线分析（melting curve analysis）简便快速地检出，使得在传统的、耗时的基于培养的支原体药敏试验之前即可明确有效抗菌药物，有望提高治愈率并减少无效抗生素的使用。

本文发表于《Microbiology Spectrum》，针对牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis，即Mycoplasmopsis bovirhinis）是日本牛群中广泛存在的呼吸道共生菌，可继发参与犊牛肺炎综合征，而传统基于培养的支原体最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定需2～3周，无法指导临床即时用药，且近年来日本多地报道该菌田间分离株对常用抗菌药（大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类）出现低敏感性。由于支原体药敏下降的主要机制为目标基因（rrl、rrs、gyrA、parC）突变及罕见的获得性修饰/保护基因（多见于前噬菌体区），本研究旨在阐明日本M. bovirhinis低敏现状、鉴定相关基因与突变，并建立基于PCR、测序和熔解曲线的遗传药敏检测方法。

研究人员收集1996—2023年日本8个都道府县100株M. bovirhinis田间分离株及模式株PG43^T，采用琼脂微量稀释法测定16种兽用抗菌药物MIC；选取对卡那霉素/新霉素/链霉素/土霉素低敏的HAZ2616株完成PacBio全基因组测序（closed circular contig），并与已发表菌株（PG43^T、HAZ141_2、GS01）进行比较基因组学分析以定位前噬菌体区耐药基因簇（aadE-sat4-aphA-3、rpp）；通过PCR扩增靶基因（rrl G748与A2058位点、gyrA与parC/parC′ QRDR、aphA-3、aadE、rpp等）及Sanger测序筛查突变与基因携带情况，统计MIC差异（Mann?Whitney U检验）；将推定功能基因（aphA-3、aadE、sat4、rpp）克隆至pMD20载体转入大肠杆菌JM109验证表型；设计M. bovirhinis特异引物与杂交探针，建立PCR及荧光共振能量转移（FRET）杂交探针熔解曲线分析检测rrl位点突变。

研究人员对100株田间分离株及PG43^T进行16种药物MIC测定。结果表明，伐奈米林（valnemulin）敏感性最高（MIC₅₀/MIC₉₀＝0.016/0.031 μg/mL），庆大霉素、大观霉素、诺司替霉素（nourseothricin）、氟甲喹（flumequine）、氟苯尼考、泰妙菌素（tiamulin）、伐奈米林MIC呈正态分布且PG43^T落于范围内，判定所有分离株对上述药物仍敏感；而卡那霉素、新霉素、链霉素、泰乐菌素（tylosin）、土霉素（oxytetracycline）及恩诺沙星（enrofloxacin）MIC呈明显双峰分布，并零星检出阿奇霉素与林可霉素低敏株；所有菌株及PG43^T对14元大环内酯类红霉素天然耐药（MIC₅₀＝256 μg/mL），缘于rrl A²⁰⁵⁷－rrl C²⁶¹¹不形成碱基配对。

HAZ2616（MIC_卡那霉素＝256 μg/mL，MIC_新霉素＞1,024 μg/mL，MIC_链霉素＞1,024 μg/mL，MIC_土霉素＝512 μg/mL）基因组947,864 bp（GC 28.09%），其中locus_tag MBVR2616_0484～0555区间长58,624 bp（GC 36.06%）含类前噬菌体结构，与HAZ141_2前噬菌体区高度相似且含TGA→Trp延伸现象。此区内鉴定到氨基糖苷修饰基因簇aadE-sat4^*-aphA-3（sat4因28 aa缺失推定失活）及上游四环素核糖体保护蛋白编码基因rpp（与TetM/TetW/TetO/TetS第一组同源）。100株田间分离株中，17株携aadE^*-sat4-aphA-3，11株携aadE-sat4^*-aphA-3，17株携rpp，5株同时携rpp与aadE-sat4^*-aphA-3。此外HAZ2616含parC同源基因parC′（氨基酸同源性＜75.9% vs 典型ParC），100株中26株仅含parC，3株仅含parC′，71株二者共存。GyrA在各株间保守（＞98.7%同源）。

测序分析发现：①rrl G748突变（G748A/G748R）致16元大环内酯类（泰乐菌素）MIC显著升高（4～64 μg/mL vs 野生型0.25～4 μg/mL，P＜0.0001），3株合并rrl A²⁰⁵⁸突变者MIC进一步升高（128～256 μg/mL）；rrl A²⁰⁵⁸突变使大环内酯类（含红霉素、阿奇霉素）及林可霉素MIC显著升高（P＜0.01），该突变株自2021—2023年采自北海道。②氟喹诺酮类低敏需gyrA与parC/parC′共突变：33株为GyrA Ser83（大肠杆菌编号）＋ParC/ParC′ Ser80错义突变，恩诺沙星MIC升至2～32 μg/mL（野生型0.125～4 μg/mL，P＜0.0001），此类菌株2001—2021年广泛分布于8县；1株为GyrA Glu87＋ParC′ Ser80突变，MIC较低（2 μg/mL）。③功能验证：aphA-3使大肠杆菌对卡那霉素、新霉素MIC升高≥64倍，携aphA-3的M. bovirhinis分离株对该两药MIC显著高于非携带者（P＜0.0001）；完整aadE使链霉素MIC在大肠杆菌及M. bovirhinis中显著升高（≥64倍／P＜0.0001），aadE^*（N端替换）无功能；具完整sat4使诺司替霉素在大肠杆菌中升高≥128倍，但M. bovirhinis田间分离株未表现诺司替霉素表型差异，可能与aadE^*-sat4重叠区及起始密码子环境有关；rpp使大肠杆菌土霉素MIC升高64倍，携rpp的M. bovirhinis分离株土霉素MIC（32～512 μg/mL）显著高于非携带者（0.5～16 μg/mL，P＜0.0001）。未检出M. bovis中报道的rrs A⁹⁶⁵、rrs A⁹⁶⁷（四环素）及rrs C¹¹⁹²（大观霉素）突变。

研究人员设计M. bovirhinis特异性引物（检测rrl G748、rrl A²⁰⁵⁸、gyrA QRDR、parC QRDR、parC′ QRDR、aadE、aphA-3、rpp及两种基因簇），经22株反刍动物支原体模式株验证种属特异性（parC′引物可非特异扩增M. verecundum gyrA部分片段）。靶基因可经PCR扩增后测序判读突变；rrl G748与rrl A²⁰⁵⁸位点可用FRET杂交探针熔解曲线分析在PCR后约30分钟内完成SNP检测——三个rrl操纵子全突变呈单一低熔点峰，部分突变呈双峰曲线。DNA样品建议来源于纯化培养物而非病灶直提，以避免混合感染误判。

研究人员发现HAZ2616前噬菌体样区域源自外源细菌，含aadE-sat4^*-aphA-3及rpp基因簇，此类区域自2001年起已在日本M. bovirhinis中广泛传播。AphA-3（磷酸化2-脱氧链霉胺）和AadE（腺苷酰化链霉胍C-6）分别介导卡那霉素/新霉素和链霉素耐药；Rpp通过与核糖体GTP结合区同源结构阻碍四环素结合，属TetM/TetW/TetO/TetS第一组，可能源自非柔膜菌纲细菌。Sat4虽在大肠杆菌中赋予诺司替霉素抗性，但在M. bovirhinis中因翻译沉默未表现表型。rrl G748突变在日本田间株中广泛存在值得关注；rrl A²⁰⁵⁸突变因可能影响生长故检出率低，与M. bovis趋势一致。M. bovirhinis多数株共载parC与parC′且均可发生QRDR错义突变，使其较其他支原体更易出现氟喹诺酮低敏株。本研究建立的遗传学药敏判定法自DNA制备起约3小时可得结果，其中熔解曲线分析可快速筛查rrl突变，必要时辅以测序验证，弥补了传统培养药敏耗时过长、无标准折点等缺陷，此前研究人员已成功将该策略应用于M. bovis与M. californicum临床指导恩诺沙星治疗使80%患牛清除病原。需注意的是parC′引物与M. verecundum gyrA有部分同源；临床检测宜用分离株DNA以防混合感染导致gyrA或parC/parC′单独突变株干扰判读。支原体感染可致免疫细胞功能抑制，抗菌治疗后仍需配合卫生措施防再感染。综上，该研究明确了日本M. bovirhinis低敏的遗传基础——获得性aadE/aphA-3/rpp基因及rrl G748/A²⁰⁵⁸、gyrA Ser83＋parC/parC′ Ser80靶位突变，并建立基于PCR与熔解曲线的快速遗传药敏检测方法，可供临床在治疗前筛选有效抗菌药物，有望改善疗效并遏制无效抗生素滥用。