|
L型钙通道CaV1.2通过调节病毒内化及内质网稳态来介导甲型流感病毒感染摘要甲型流感病毒因其高突变率以及抗病毒药物耐药性的出现，依然构成全球性的重大健康威胁。针对宿主因子进行干预是一种克服这些难题的替代性治疗策略。先前的研究已表明L型钙通道Cav1.2与病毒感染有关。在本研究中，我们利用二氢吡啶类钙通道阻断剂尼索地平，旨在阐明Cav1.2作为关键宿主因子在甲型流感病毒感染中所起的作用机制。实验结果显示，尼索地平在体外和体内模型中均展现出显著的抗病毒活性。从机制上来看，尼索地平通过抑制Cav1.2来阻止甲型流感病毒的内化，进而抑制与病毒内化相关的Ras-PI3K-AKT、RhoA-ROCK和JNK通路的钙依赖性激活。此外，尼索地平还能通过促进适应性XBP1剪接来调节宿主细胞中的未折叠蛋白反应，从而有助于在甲型流感病毒感染期间维持内质网的稳态。综上所述，这些发现支持了一种级联反应模型：抑制Cav1.2能够限制病毒进入，并间接减轻病毒引发的内质网应激。此外，尼索地平还对多种包膜RNA和DNA病毒具有广谱的体外抗病毒活性，包括人类冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、寨卡病毒、登革热2型病毒以及单纯疱疹病毒1/2型。本研究阐明了Cav1.2在甲型流感病毒感染中的作用机制，同时指出其作为一种具有广阔应用前景的广谱抗病毒靶点，有望用于预防和治疗流感、人类冠状病毒感染以及其他新出现的病毒性疾病。 引言甲型流感病毒是一种具有传染性的呼吸道病原体，长期以来一直对全球人类健康构成威胁。由该病毒引发的季节性疫情以及偶发的全球性大流行会带来较高的发病率、死亡率以及巨大的经济负担[1]。虽然疫苗接种是主要的预防手段，但由于病毒表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶的快速抗原漂移和变异，疫苗的效力常常受到影响，而这又为新的流行株和大流行株的出现创造了条件[2]。因此，全球每年约有29万至65万人因流感而死于呼吸系统疾病[3]。此外，当流感与其他呼吸道病原体如肺炎链球菌、呼吸道合胞病毒以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型共同感染时，还会进一步加重病情并提高死亡风险[4]、[5]、[6]。 传统上，用于治疗流感的抗病毒药物主要分为两类：一类是针对病毒M2离子通道的药物，如金刚烷胺和利巴韦林；另一类则是抑制病毒神经氨酸酶的药物，如奥司他韦和扎那米韦。然而，由于耐药性病毒株的广泛存在，这类药物在临床治疗中的效果已大大降低[7]、[8]、[9]。为了解决这一问题，近年来出现了一些新的抗病毒药物，比如针对流感病毒PA亚基的帽依赖性内切酶抑制剂巴洛沙韦马boxil，以及广谱RNA聚合酶抑制剂法匹拉韦。尽管这些药物显示出较强的抗病毒活性，但它们也面临着耐药性问题以及临床应用范围有限的困境[10]、[11]、[12]、[13]。为了在克服耐药性的同时实现广谱抗病毒效果，开发以宿主因子为靶点的抗病毒策略显得尤为重要。 宿主离子通道在细胞的诸多生理过程中起着至关重要的作用，包括信号转导、囊泡运输以及稳态维持等[14]。越来越多的证据表明，从流感病毒到冠状病毒，各类病毒都会主动劫持宿主离子通道，以此推动其生命周期中的关键步骤，包括病毒进入细胞、复制以及释放等[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。尤其是钙、钾和氯离子通道，它们参与调控病毒的进入过程以及膜融合现象[20]、[21]。例如，TRPV2介导的钙离子内流能够控制膜流动性，从而帮助单纯疱疹病毒进入髓系细胞[22]。这些研究结果表明，宿主离子通道是开发不易产生病毒耐药性的广谱抗病毒药物的理想靶点。 电压门控钙通道，尤其是L型钙通道，是调控细胞内钙离子动态的关键因素，同时参与多种生理过程[23]、[24]、[25]。在L型钙通道中，Cav1.2在心脏、大脑和肺部等组织中广泛存在[26]、[27]。它在平滑肌收缩、气道反应性以及肺血管重构过程中发挥着重要作用，这表明它与肺部的生理功能和病理变化密切相关[28]。最近的研究提示，L型钙通道介导的钙信号也可能与病毒感染有关。例如，维拉帕米已被证明能够抑制流感病毒和牛疱疹病毒的复制[29]、[30]，而硝苯地平则可以阻止SARS-CoV2进入细胞[31]。这些发现共同表明，钙通道Cav1.2可能在病毒感染过程中起到关键的宿主决定因素作用。不过，Cav1.2的具体作用机制仍不清楚，尚不确定它是否直接促进甲型流感病毒进入细胞、调控下游信号传导途径，或是影响宿主细胞的应激反应。 病毒的内化是一个复杂的过程，需要依赖多种宿主信号通路，比如Ras-磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路[32]、[33]、[34]，RhoA-Rock信号通路[35]、[36]、[37]，以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路[38]、[39]、[40]。这些通路负责调控细胞骨架的重塑、内吞作用以及囊泡运输，对于病毒的进入和在细胞内的移动至关重要。 此外，已有研究表明，甲型流感病毒感染会引发未折叠蛋白反应，这是一种应激反应机制，其触发原因是病毒复制早期阶段，病毒蛋白在內质网中大量积累，导致蛋白质无法正常折叠[41]、[42]、[43]。内质网应激所引发的未折叠蛋白反应会调控细胞骨架的动态以及内吞信号通路，进而影响宿主细胞的存活状态。在感染初期，甲型流感病毒引起的轻度内质网应激和未折叠蛋白反应会改变宿主细胞的细胞骨架和内吞途径，为病毒进入细胞创造有利条件，同时不会引发细胞凋亡。这与感染后期病毒蛋白大量积累所导致的严重内质网应激情况有所不同。因此，甲型流感病毒演化出了利用早期未折叠蛋白反应来辅助自身进入细胞的策略。不过，在甲型流感病毒感染过程中，钙通道活性与这些与未折叠蛋白反应相关的信号通路之间的功能相互作用目前尚未得到研究。 我们之前的研究已经证明，包括尼索地平和西尼地平在内的二氢吡啶类钙通道阻断剂，在体外和体内环境中都对甲型流感病毒具有强大的抗病毒活性[44]、[45]。然而，这种抗病毒效应背后的具体上游分子机制，包括关键的宿主靶点以及相关调控网络，至今仍未完全明确。本研究的目的是明确钙通道Cav1.2在甲型流感病毒感染中的作用，具体探讨Cav1.2仅仅是作用于病毒进入细胞的过程，还是会在甲型流感病毒生命周期的多个阶段发挥调控作用。本研究进一步阐明了这种抗病毒效应的上游分子机制，确定Cav1.2是介导甲型流感病毒感染的重要的宿主因子和潜在治疗靶点，同时揭示了尼索地平的抗病毒机制：它通过靶向Cav1.2来阻止病毒的内化和膜融合，进而通过调节未折叠蛋白反应的稳态来缓解甲型流感病毒引发的内质网应激。此外，本研究还验证了尼索地平对多种包膜RNA和DNA病毒具有广谱的体外抗病毒活性，这些病毒包括人类冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、寨卡病毒、登革热2型病毒以及单纯疱疹病毒1/2型。综上所述，这些研究结果不仅揭示了Cav1.2的抗病毒机制，还将它确定为可用于体外广谱抗病毒治疗的潜在靶点。 章节节选 试剂、抗体及质粒尼索地平、LY294002和Y-27632购自中国上海的Topscience公司。奥司他韦磷酸盐由中国杭州的杭州赛诺佩普制药有限公司提供。SP600125则来自美国新泽西州蒙茅斯琼特的MedChemExpress公司。TPCK-胰蛋白酶和土霉素则购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。琼脂糖来自法国努艾耶的Biowest公司，而PstI-HF限制性内切酶则来自美国马萨诸塞州伊普斯威奇的New England Biolabs公司。 商业来源 Cav1.2调控甲型流感病毒感染为探究钙通道Cav1.2对甲型流感病毒感染的影响，本研究采用了双重策略，即同时进行Cav1.2基因的敲低和过表达操作，并结合多种检测方法来评估Cav1.2对甲型流感病毒复制的调控作用。研究成功构建并验证了稳定的Cav1.2敲低细胞模型（见图1a、b）以及Cav1.2过表达细胞模型（见图1f、g）。随后，将各组细胞在37℃下以MOI=0.1的比例感染A/WSN/1933（H1N1）株甲型流感病毒，感染时间为1小时，之后 讨论由于耐药性病毒株的不断出现，现有抗病毒药物的效果逐渐减弱，因此甲型流感病毒依然是全球公共卫生领域的重要问题。以宿主为靶点的治疗策略被视为一种很有前景的替代方案。不过，这类策略能否在临床上得到应用，取决于两个关键条件：一是要找到在病毒感染过程中起重要作用的宿主因子，二是要证明针对这些因子进行治疗确实能够产生有效的、具有广谱作用的疗效 |
