荧光定量PCR：原理及应用

荧光定量 PCR 原理

荧光定量 PCR 最早称 TaqMan PCR ，后来也叫 Real-Time PCR ，是美国 PE （ Perkin Elmer ）公司 1995 年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规 PCR 基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加， PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值（如下图所示）。

荧光域值（ threshold ）

是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是 PCR 反应前 3-15 个循环荧光信号标准偏差的 10 倍，即： threshold 。

Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。

Ct 值与起始模板的关系：

研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值如下图所示。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量检测

荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括 Beacon 技术（分子信标技术，以美国人 Tagyi 为代表）、 TaqMan 探针（以美国 ABI 公司为代表）和 FRET 技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的 SYBR Green Ⅰ；饱和荧光染料有 EvaGreen 、 LC Green 等。

嵌合荧光染料法（ SYBR Green Ⅰ）

SYBR Green I 是荧光定量 PCR 最常用的 DNA 结合染料，与双链 DNA 非特异性结合。在游离状态下， SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合，其荧光增加 1000 倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。

SYBR Green I 荧光染料与 DNA 双链的结合

双链 DNA 结合染料的优点：实验设计简单，仅需要 2 个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。

荧光探针法（ Taqman 技术）： PCR 扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示

荧光定量 PCR 的应用

分子生物学研究

1 核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型 H1N1 流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。

2 基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证

3 SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

4 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

医学研究

5 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少 X 连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿 DNA ，用实时荧光定量 PCR 检测其 Y 性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。

6 病原体检测：采用荧光定量 PCR 检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、 EB 病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

7 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV) 、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。 HCV 高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而 HCV 低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中， HBV- DNA 的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。

8 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR 不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶 hTERT 基因、慢性粒细胞性白血病 WT1 基因、肿瘤 ER 基因、前列腺癌 PSM 基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。