探索杜氏肌营养不良症新机制：转录适应上调乌达肌动蛋白的研究突破

在生命科学领域，杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）一直是研究的重点与难点。近日，来自马克斯?普朗克心肺研究所（Department of Developmental Genetics, Max Planck Institute for Heart and Lung Research）的 Lara Falcucci 等人，在顶尖学术期刊《Nature》上发表了题为 “Transcriptional adaptation upregulates utrophin in Duchenne muscular dystrophy” 的论文。这一研究成果为 DMD 的治疗开辟了新的思路，在医学健康领域尤其是肌肉疾病研究方向具有重要意义。

研究背景：迷雾中探寻真相

DMD 是一种 X 连锁隐性遗传性神经肌肉疾病，由 DMD 基因突变引起，该基因编码的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）是连接细胞骨架与细胞外基质的关键蛋白，能保护肌肉细胞免受收缩损伤。目前，FDA 批准的治疗方法包括针对特定缺失的外显子跳跃疗法、通读终止密码子的化合物以及重组基因疗法等，但这些疗法仍存在诸多局限性 。

乌达肌动蛋白（Utrophin，UTRN）作为 DMD 的遗传和功能同源物，在部分 DMD 患者中会出现上调现象。临床前研究发现，UTRN 的表达与 DMD 疾病进程的严重程度呈负相关，mdx DMD 小鼠模型（其 Dmd 基因外显子 23 存在无义突变）中也观察到 UTRN 上调，且 mdx/Dmd 突变小鼠的表型比 Utrn/Dmd 双突变小鼠更轻。这表明 UTRN 上调可能是一种补偿机制，能部分抵消抗肌萎缩蛋白的缺失，是治疗 DMD 的潜在策略。然而，UTRN 上调的机制却一直笼罩在迷雾之中，以往大多认为是抗肌萎缩蛋白缺失所致，但缺乏足够的证据支持。

研究方法：解锁关键技术密码

为了揭开 UTRN 上调机制的神秘面纱，研究人员采用了一系列先进且巧妙的技术方法。

1. 构建诱导型 mRNA 降解系统：研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术，在 HEK293T 细胞的 DMD 基因外显子 37（E37）中引入提前终止密码子（PTC），构建了携带 PTC 的 DMD 等位基因（）细胞系。通过这种方式，模拟 DMD 患者中因基因突变导致的 mRNA 异常，为后续研究奠定基础。

2. 调控转录延伸速率：使用 DNA 拓扑异构酶 I 抑制剂喜树碱（CPT）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A（TSA）。CPT 可间接抑制转录延伸，TSA 则能促进转录延伸，通过观察这两种药物对 DMD E37 剪接的影响，研究转录延伸速率与外显子包含之间的关系。

3. 基因过表达与敲低实验：在细胞中过表达 DMD 基因，观察对 UTRN 表达的影响；同时，利用小干扰 RNA（siRNA）敲低无义介导的 mRNA 降解（NMD）途径中的关键蛋白 UPF1 和 SMG6，探究 NMD 在 UTRN 上调中的作用。

4. 构建迷你基因与转染实验：构建不同的 DMD 迷你基因，包括含有 PTC 的迷你基因和携带自切割核酶（T3H38-HHR）的 DMD 迷你基因，并将它们转染到多种细胞系（如 WT HEK293T、HAP1、HeLa 细胞以及肌管细胞）中，研究这些迷你基因对 UTRN 表达的影响。

5. 反义寡核苷酸（ASO）实验：设计并使用 ASO，通过诱导 DMD 基因外显子跳跃，引入 PTC 或恢复阅读框，观察对 DMD 和 UTRN 表达的影响。在 WT 肌管细胞和 DMD 患者来源的肌管细胞中进行实验，评估 ASO 在疾病治疗中的潜在应用。

研究结果：照亮黑暗的曙光

增强 DMD E37 的包含

研究人员发现，CPT 处理野生型（WT）HEK293T 细胞会导致 DMD E37 跳跃，而 TSA 处理则促进 E37 的包含，这表明 DMD E37 的包含遵循共转录剪接的动力学模型，且转录延伸速率对其有显著影响。

在 DMD E37 中引入 PTC

成功构建细胞系后，研究发现该细胞系中 DMD E37 的跳跃频率比 WT 细胞更高，可能是因为缺失的 20-nt 序列中含有多个剪接增强子。

DMD 的包含触发 UTRN 上调

当诱导细胞中含 PTC 的 E37 包含时，DMD mRNA 水平显著降低，同时 UTRN mRNA 和蛋白水平显著上调。进一步研究发现，UTRN 上调是由于转录增加，而非抗肌萎缩蛋白的缺失。

DMD mRNA 降解先于 UTRN 上调

TSA 处理对 DMD E37 包含的影响呈剂量和时间依赖性。随着 TSA 浓度增加和处理时间延长，DMD mRNA 水平下降，UTRN mRNA 水平上升。且去除 TSA 后，DMD 和 UTRN mRNA 水平可恢复正常，这表明 UTRN mRNA 水平的变化是由 DMD 突变 mRNA 降解引起的。

阻断 NMD 使 UTRN 上调正常化

敲低 UPF1 和 SMG6 阻断 NMD 后，细胞中 DMD 突变 mRNA 水平增加，UTRN mRNA 和前体 mRNA（pre-mRNA）水平的上调消失，说明 DMD 突变 mRNA 降解是触发 UTRN 上调的必要条件。

DMD 过表达不降低 UTRN 上调

在细胞中过表达 DMD，UTRN mRNA 和 pre-mRNA 的上调不受影响，表明 UTRN 上调是由 DMD 突变 mRNA 降解引发的转录适应（TA）导致，而非抗肌萎缩蛋白的反馈作用。此外，研究人员还发现了其他可能通过 TA 补偿抗肌萎缩蛋白缺失的基因，如 ANO5、ACTA1 等。

迷你基因触发 UTRN 上调

将迷你基因转染到多种细胞系中，发现大多数细胞系中，转染迷你基因的细胞 UTRN mRNA 水平升高，且不同细胞系对 UTRN 上调的反应存在差异，这进一步证明 DMD 突变 mRNA 降解可触发 UTRN 上调。

迷你基因触发 UTRN 上调

携带自切割核酶（T3H38-HHR）的 DMD 迷你基因转染实验表明，活性核酶可导致 DMD mRNA 水平下降，同时多数细胞系中 UTRN mRNA 水平升高，再次验证了 DMD mRNA 降解是 UTRN 上调的主要触发因素。

肌管显示 UTRN 上调

在 DMD 患者来源的肌管中，研究人员观察到 DMD mRNA 水平降低，UTRN mRNA 和 pre-mRNA 水平升高，表明 UTRN 上调是由于转录增加。使用 ASO 恢复肌管的 DMD 阅读框后，UTRN 上调减少；而转染携带活性核酶的 DMD 迷你基因则可增强 UTRN 上调。

剪接转换 ASO 可触发 UTRN 上调

在 WT 肌管细胞中，转染针对 DMD 基因外显子 E6 和 E52 的剪接转换 ASO，可诱导外显子跳跃，引入 PTC，从而触发 DMD 突变 mRNA 降解和 UTRN 上调。部分外显子跳跃也能导致 UTRN 上调，且不会显著降低 DMD mRNA 或蛋白水平。在小鼠 C2C12 骨骼肌细胞系中进行类似实验，也观察到 Utrn 上调，说明 TA 在小鼠和人类细胞中均可触发 Utrn/UTRN 上调。

研究结论与讨论：开启未来新征程

这项研究通过多种实验方法，有力地证明了 DMD mRNA/pre - mRNA 降解足以上调 UTRN，且 NMD 在细胞的 UTRN 上调中起着关键作用。转录适应（TA）作为一种新发现的细胞反应，在 DMD 患者 UTRN 上调中发挥了重要作用，这是首次在人类中发现 TA 的实例及其在遗传性疾病中的潜在作用。

对于 DMD 患者的治疗，这一研究成果意义非凡。目前的治疗方法虽有一定效果，但存在局限性。基于此研究，使用含有自切割核酶的 DMD 和 / 或 UTRN 迷你基因，可能会增强 UTRN 上调，与现有的治疗方法（如 eteplirsen 治疗）协同作用，为 DMD 患者带来更好的治疗效果 。此外，研究中利用 DMD E37 可变剪接创建的诱导型 DMD 突变 mRNA 降解模型，是一种全新的工具，可用于诱导内源性 mRNA 降解，为研究其他基因的功能提供了新的思路和方法。

在更广泛的层面，TA 机制的发现为理解遗传稳健性提供了新的视角。在许多人类遗传疾病中，错义突变比导致 mRNA 降解的移码或无义突变更为常见，且错义突变往往具有更有害的影响。TA 介导的功能补偿或许可以解释为什么无义突变的报道相对较少，因为它们可能导致较轻的表型。

这一研究也为开发新的治疗策略开辟了道路。ASO 已被 FDA 批准用于多种疾病的治疗，本研究展示了其新的应用，即通过诱导突变 mRNA 降解，触发 TA 实现功能补偿。此外，迷你基因与自切割核酶的组合，以及其他新兴技术（如邻近诱导核酸降解剂），都有望成为治疗多种遗传疾病的有效手段 。未来，研究人员还将进一步探索 RNA 干扰和其他 RNA 降解形式是否能触发 TA 或类似反应，为攻克更多遗传疾病带来新的希望。