摘要：细胞外染色质片段，包括细胞游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)和组蛋白，已成为癌症筛查和监测中极具前景的非侵入性生物标志物。虽然cfDNA中异常的DNA甲基化模式已被确立为癌症的标志性特征，并越来越多地应用于液体活检检测中，但循环中的组蛋白和核小体反映了肿瘤相关表观遗传失调和染色质重塑的互补方面。本综述整合了当前关于癌症中细胞内和细胞外组蛋白的知识，强调了它们通过坏死、凋亡或中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)释放的机制，以及它们作为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)和肿瘤微环境调节因子的双重角色。研究人员讨论了DNA甲基化与组蛋白修饰、组蛋白变体以及翻译后修饰之间的复杂机制联系，包括由DNMTs、UHRF1和PAD4等酶介导的双向串扰。特别强调了NETosis及其表观遗传调控，这进一步将组蛋白瓜氨酸化与DNA甲基化机制和肿瘤进展联系起来。研究人员评估了将cfDNA甲基化谱分析与循环组蛋白水平、组蛋白变体和核小体相关翻译后修饰相结合的临床潜力。来自多种癌症类型的证据表明，在几种癌症中，整合了片段组学(fragmentomics)、组蛋白标志物和甲基化特征的多模态表观遗传方法，相比单一模态或传统蛋白质生物标志物，显著提高了诊断准确性、组织来源识别和早期检测能力。片段组学反映了核小体定位和染色质可及性，为基于甲基化的检测方法增加了一个功能层面。总之，细胞外染色质成分提供了一个丰富的、生物学上相互关联的信息来源。它们的整合分析通过改进筛查、预后、治疗监测和开发更安全的表观遗传疗法，为推进精准肿瘤学具有重要前景。
1. 引言
过去几十年，我们对人类基因组的理解已从将DNA视为静态蓝图转变为认识到它是一个由复杂化学“开关”层调控的动态系统。DNA甲基化是一种基本的表观遗传机制，对于哺乳动物细胞中基因表达调控、基因组印记和染色体稳定性维持至关重要。这一生化过程涉及甲基基团添加到胞嘧啶的5′位置，通常发生在CpG二核苷酸上形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)，从而在不改变底层DNA序列的情况下调控染色质结构。DNA甲基化作为细胞过程守护者的关键作用，可通过以下事实得到充分说明：从单个受精卵准确分化为数百种特化细胞类型需要显著的去甲基化和从头甲基化。这些严格调控的甲基化模式的破坏是多种病理状况的标志，包括自身免疫性疾病，尤其是癌症，其中肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene, TSG)启动子的异常高甲基化和整体低甲基化共同促进肿瘤发生和疾病进展。在癌症中DNA甲基化调控景观的补充方面，染色质的结构组织由核心组蛋白调控，它们作为DNA压缩和核结构的核心蛋白质介质，将在后续章节中说明。
2. 癌症中的细胞内和细胞外组蛋白
组蛋白是小的、高度保守的碱性蛋白质，在真核生物进化早期起源，作为组织日益复杂基因组的DNA包装分子。古菌中类组蛋白的存在以及它们在真核生物中的保守性反映了维持核小体结构和基因组完整性所需的结构限制。核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4组装成八聚体结构，大约147个碱基对的DNA缠绕其上，形成染色质组织的第一个基本单位——核小体，促进了基因组的分级包装。连接组蛋白H1在DNA进入和出口位点结合，稳定高阶染色质结构，并进一步将核小体压缩成染色质纤维，最终将基因组组织成细胞核内的染色体。真核染色质是一个高度动态的结构，核小体颗粒通过染色质重塑复合物在组成、结构和位置上发生修饰。经典组蛋白在S期表达，而组蛋白变体通常在整个细胞周期中以不依赖复制的方式表达并整合到染色质中。组蛋白变体可表现出组织特异性和条件特异性表达与功能，通过改变组蛋白-组蛋白或组蛋白-DNA相互作用以及核小体稳定性来改变染色质。除了组蛋白替换之外，核心组蛋白和组蛋白变体还经历多种翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)，包括乙酰化、甲基化和磷酸化，它们共同构成一个动态的表观遗传密码，为基因组功能提供额外的调控水平。
癌症作为纯粹遗传疾病的经典观点已演变为包含表观遗传失调在决定细胞身份和肿瘤进展中的核心作用。例如，癌组蛋白(oncohistone)的概念是在鉴定到复发性错义突变H3K27M和H3G34R/V作为儿童胶质瘤发生驱动因素后确立的，这些突变通过废除Polycomb介导的抑制和损害SETD2介导的H3K36三甲基化而发挥作用。macroH2A家族(macroH2A1和macroH2A2)通常通过强制细胞休眠和抑制致癌增强子来发挥肿瘤抑制作用。然而，两个macroH2A1剪接变体macroH2A1.1和macroH2A1.2之间存在关键的功能分化：macroH2A1.1作为抑制因子，在高级别肿瘤中经常丢失，并通过PARP1结合抑制增殖，而macroH2A1.2缺乏结合ADP-核糖的能力，通常与促肿瘤或背景依赖的作用相关。因此，虽然一些变体增强致癌通路，但另一些通过维持染色质完整性起保护作用。最近对超过12,000名患者的分析发现约16%的癌症患者存在组蛋白突变。新证据已确定组蛋白H4中潜在的驱动突变。错义突变常影响酸性斑块残基或蛋白质结合界面，破坏DNA修复机制并导致严重的基因组不稳定。组蛋白“写入器”、“擦除器”和“读取器”活性或表达的改变可将染色质状态转向支持肿瘤的转录重编程，导致关键标记如甲基化和乙酰化的平衡失调，从而影响增殖、凋亡和细胞分化等过程。总之，从稳定的经典染色质状态转变为富含特定变体、癌组蛋白突变和失调PTMs的状态，代表了肿瘤起始的基本机制(图1)。
组蛋白可在细胞应激和损伤条件下释放到细胞外空间。细胞外组蛋白的来源主要包括坏死或凋亡细胞的被动释放，以及活化中性粒细胞通过裂解性或非裂解性NETosis主动分泌的中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。NETs的作用及其与DNA甲基化的联系将在本综述后面部分讨论。一旦离开细胞，组蛋白作为损伤相关分子模式(DAMPs)结合并激活模式识别受体，特别是Toll样受体(TLR2和TLR4)，导致NF-κB信号通路的下游激活和促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的产生。此外，组蛋白已被证明通过其高度阳离子性质直接破坏细胞膜来诱导细胞毒性。此外，细胞外组蛋白通过调节巨噬细胞极化、抑制巨噬细胞对凋亡细胞的摄取和清除、促进巨噬细胞焦亡来支持促炎环境。这有助于组织损伤并放大炎症级联反应，产生损伤和免疫激活的自我维持循环。在癌症背景下，细胞外组蛋白在塑造肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中发挥重要作用(图1)。通过其促炎和细胞毒性特性，它们可以促进支持肿瘤进展的微环境。组蛋白H3被认为在TME内低氧条件下释放到细胞质和细胞外空间后促进癌细胞增殖和转移。体外实验表明，细胞外组蛋白可诱导免疫抑制性Treg细胞群扩增。此外，组蛋白可能通过与syndecan-4(SDC4)相互作用，作为肿瘤来源外泌体和纳米颗粒摄取的关键配体，从而促进肿瘤微环境中的细胞间通讯和代谢转变。有趣的是，自然杀伤(NK)细胞被发现通过一种与中性粒细胞中观察到的细胞外陷阱形成非常相似的过程主动释放组蛋白。这种特殊机制在NK细胞与多发性骨髓瘤(MM)细胞直接接触时被激活，导致组蛋白H2AZ和H4的释放，通过结合CD138受体并形成NK-MM和T细胞-MM细胞簇来促进抗肿瘤活性，从而使效应细胞与恶性细胞紧密接近并促进更有效的肿瘤清除。
细胞外组蛋白的释放可在循环中检测到，并已成为危重患者(特别是脓毒症、创伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和COVID-19病例)诊断、预后和治疗监测的有价值的生物标志物。此外，癌症患者中发现循环中组蛋白和组蛋白复合物(如核小体)水平改变(主要是升高)。我们和其他研究者的研究表明，它们作为多种癌症类型检测、分类和监测的有价值标志物。
3. 癌症中的DNA甲基化
异常DNA甲基化是癌症的标志，直接导致肿瘤起始、进展和治疗反应。癌症相关的甲基化改变通常涉及整体低甲基化和位点特异性启动子高甲基化的“双重打击”。全基因组低甲基化促进染色体不稳定、转座子重新激活和癌基因激活，而启动子CpG岛高甲基化使TSGs、DNA修复因子以及细胞周期控制和凋亡调节因子沉默。这些模式不仅仅是伴随事件，而是与疾病过程功能相关，并常反映关键基因-环境相互作用(图1)。
癌症全甲基化组显示可重复的、肿瘤类型特异性的特征，而不是随机的表观遗传漂移。大规模谱分析研究表明，不同癌症具有影响细胞增殖、免疫逃逸、代谢重编程和DNA损伤反应等通路的特征性差异甲基化模式。在肺癌中，全基因组甲基化组分析确定了DNMT介导的TSGs和免疫调节因子沉默，强调异常甲基化作为非小细胞肺癌的生物标志物和治疗靶点。同样，结直肠癌和其他癌症中的CpG岛甲基化表型定义了具有预后和治疗意义的分子亚型。
近期证据表明，癌细胞依赖特定的DNA甲基化状态生存。在癌细胞中实验性消耗DNA甲基转移酶(DNMT)活性可诱导衰老和增殖能力丧失，独立于经典肿瘤抑制通路，证明维持性甲基化是肿瘤细胞持续适应度所必需的。此外，增强子和超级增强子处的异常甲基化控制致癌转录程序，将远端调控甲基化改变与转移、免疫逃逸和治疗耐药联系起来。这些发现扩展了早期以启动子为中心的观点，并强调三维染色质组织和转录因子占据在表观遗传调控肿瘤发生中的重要性。
泛癌症表观基因组分析揭示了与致癌信号网络和肿瘤微环境相互作用相关的保守和肿瘤特异性甲基化程序。DNA甲基化标志物在无细胞片段中的高稳定性使液体活检能够有效捕获远处肿瘤的表观遗传景观，通过微创方法为癌症发病机制的分子驱动因素提供关键见解，并因此用于癌症检测、分类、管理和微小残留病(minimal residual disease, MRD)监测。肿瘤特异性甲基化标志物已被纳入临床批准的诊断检测中，并越来越多地用于预测预后和治疗效果。例如，胶质母细胞瘤中DNA修复基因MGMT的启动子甲基化可预测对烷化剂化疗的反应，说明了表观遗传生物标志物在肿瘤学中用于亚型和患者分层的直接转化相关性。
表观遗传修饰具有潜在可逆性，为使用“表观遗传药物”提供了干预机会。靶向异常DNA甲基化已成为精准肿瘤学的主要策略。DNA甲基转移酶抑制剂，包括阿扎胞苷、瓜地他滨和地西他滨，是血液系统恶性肿瘤的既定治疗方法，并正在积极研究与免疫检查点阻断、靶向激酶抑制剂和放疗联合使用。近期研究表明，去甲基化药物可诱导病毒拟态通路、增强抗原呈递并增加肿瘤免疫原性，为表观遗传-免疫治疗联合提供了机制基础。靶向DNMTs、TET酶和甲基化调控染色质复合物的下一代表观遗传药物目前正在临床开发中。
4. DNA甲基化与核组蛋白之间的联系：对癌症的影响
DNA甲基化，特别是5mC，作为甲基化CpG结合域(Methyl-CpG-Binding Domain, MBD)蛋白的对接位点。MeCP2和MBD2等蛋白作为分子桥梁，识别甲基化DNA并随后招募组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases, HDACs)和组蛋白甲基转移酶(Histone Methyltransferases, HMTs)。相反，组蛋白翻译后修饰(PTMs)经常调节DNA甲基化的发生。例如，H3K4甲基化抑制DNMT3A，从而保护活性启动子免受从头DNA甲基化。研究表明，MBD蛋白和DNA甲基转移酶与组蛋白甲基化机制参与相互招募，从而建立自我强化的异染色质状态。MeCP2被证明与H3K9甲基转移酶机制相关，而DNMT3A被发现与含组蛋白去乙酰化酶的抑制复合物相互作用，进一步说明了DNA甲基化和组蛋白修饰在转录沉默中的双向串扰。相比之下，H3K9me3作为许多生物体中招募DNMTs的信号，表明组蛋白定义的异染色质通常先于并指导DNA甲基化的沉积以确保长期沉默。同样，Polycomb抑制的染色质结构域在肿瘤发生过程中可成为异常从头DNA甲基化的靶标。在结直肠癌和其他恶性肿瘤中，干细胞中带有Polycomb相关H3K27me3标记的基因被证明优先获得启动子CpG岛高甲基化，表明组蛋白定义的染色质状态可使位点预先具备在癌症中通过DNA甲基化介导的稳定沉默能力。除PTMs外，某些组蛋白变体的掺入显著改变了衰老和癌症中的DNA甲基化谱。在这方面，我们之前报道过，DNMT抑制诱导的肝细胞癌(HCC)衰老是由H2A组蛋白变体macroH2A1和DNA低甲基化介导的。此外，DNA甲基化和macroH2A1占据在表观遗传沉默中的协同作用发生在TSG p16(CDKN2A)以及核糖体DNA水平。组蛋白变体H2A.Z常见于启动子处，通常与DNA甲基化相互排斥。H2A.Z的存在作为阻止DNA甲基化扩散到活性基因的屏障。这种相互拮抗基于DNA甲基化依赖性排斥或 destabilization of H2A.Z，以及H2A.Z依赖性保护免受DNA甲基化。H3.3通常与高转录转换相关，可通过调节DNA模板对甲基化酶的可及性来影响“表观遗传记忆”。H3.3通常与H2A.Z一起促进以核小体转换增加为特征的动态染色质环境。在H3.3缺陷细胞中，连接组蛋白H1以转录依赖方式在基因体内积累。由于H1促进高阶染色质压缩并结合接头DNA，其积累可限制DNMT对DNA模板的可及性。结构研究已确定DNMTs本身的“读取器”模块。DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L的ATRX-DNMT3-DNMT3L(ADD)结构域识别H3K4的未甲基化状态，从而解除ADD-甲基转移酶自抑制相互作用并激活酶活性。相反，甲基化的H3K4维持DNMT3A自抑制并保护活性染色质免受从头DNA甲基化。这提供了一个直接的生化联系，其中组蛋白尾部作为“传感器”切换DNA甲基化机制的酶活性开或关。在血液癌症中，ADD结构域突变导致DNMT3A功能获得，通过失去自抑制导致异常高甲基化。同样，ATRX突变与肿瘤发生密切相关，特别是胶质瘤和神经母细胞瘤。ATRX与死亡结构域相关蛋白(DAXX)一起促进组蛋白变体H3.3掺入端粒和着丝粒周围异染色质。H3.3、ATRX和DAXX的体细胞突变常见于儿童胶质母细胞瘤(GBM)患者，强调了功能失调的染色质调节因子作为癌症驱动因子的作用。
UHRF1(Ubiquitin-like with PHD and Ring Finger domains 1)是确保DNA甲基化和组蛋白标记一起遗传的关键因子。UHRF1在复制期间充当“读取器”，通过其Tudor和PHD结构域以及SRA结构域分别同时扫描染色质上的两个特定信号：H3K9me2/3和半甲基化DNA。一旦UHRF1停靠到这个特定的“H3K9me3+半甲基化DNA”平台，它将DNMT1(DNA甲基转移酶1)招募到复制叉。UHRF1利用其RING结构域在赖氨酸18或23处泛素化组蛋白H3(H3K18ub/H3K23ub)，导致DNMT1被招募到该位点并甲基化新合成的子链。UHRF1对于DNMT1靶标识别至关重要，直接将DNA甲基化与组蛋白密码联系起来。UHRF1过表达在多种实体瘤和血液肿瘤中观察到，通过招募DNMT1和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)导致TSG沉默。破坏UHRF1-H3K9me3相互作用，例如通过小分子拮抗剂NV03，可损害UHRF1与染色质的结合，并可能减少TSG的异常DNA甲基化。同样，抑制或缺失H3K9甲基转移酶G9a可降低H3K9me2水平并逆转UHRF1相关的表观遗传沉默。
最后，特定的组蛋白PTMs改变染色质动力学，从而影响基因表达并触发疾病特异性功能异常。这种染色质可及性的变化与基因启动子区域的DNA甲基化变化直接相关。例如，发现H3K4me2增加与三阴性乳腺癌(TNBC)表型相关基因(包括PLA2G4A、IGF2BP3、AIM2)之间存在因果关系。同样，异常的H3K36me2导致DNMT3A基因间区域重新分布，导致全基因组表观遗传改变。机制上，H3K36甲基化景观通过DNMT3A和DNMT3B的PWWP结构域识别直接指导DNMT3家族定位。全基因组谱分析研究表明，H3K36甲基化调节从头DNA甲基转移酶在基因体和基因间染色质上的分布。后来发现升高的H3K36me2招募DNMT3A并塑造癌症中的基因间DNA甲基化景观。在多种实体瘤中观察到H3K36me2水平升高，包括肺腺癌、前列腺癌和膀胱癌，通过诱导促癌基因表达(如参与上皮-间质转化(EMT)的因子)促进肿瘤进展。相反，头颈癌中H3K36me2水平缺失(由功能丧失NSD1突变驱动)导致广泛的基因间低甲基化。在这种缺失范例的基础上，软骨母细胞瘤中的H3.3K36M癌组蛋白已被证明通过隔离甲基转移酶来全局抑制H3K36me2，从而瓦解正常分化所需的表观遗传景观。这些例子突出了组蛋白标记如何指导DNA甲基化模式；然而，这种关系基本上是双向的。里程碑式的研究已经确定，DNA甲基化本身作为招募组蛋白修饰酶(如组蛋白去乙酰化酶)的支架，以确保抑制性染色质状态的稳定维持和遗传。这种反馈回路创造了强化的表观遗传“记忆”，其中DNA甲基化和组蛋白标记相互维持以锁定细胞身份。
5. DNA甲基化和中性粒细胞胞外陷阱(NET)：对癌症的影响
癌症越来越被认为是一种由肿瘤细胞、免疫细胞和肿瘤微环境中表观遗传失调之间复杂相互作用塑造的疾病。肿瘤相关中性粒细胞已成为癌症进展的关键调节因子，能够通过细胞因子信号和基于染色质的机制促进血管生成、免疫抑制和转移播散。浸润肿瘤的活化中性粒细胞表现出增强的释放NETs能力，NETs是由去浓缩DNA和组蛋白组成的细胞外染色质结构，影响肿瘤生长和转移。NETs中的细胞外组蛋白对周围基质细胞和免疫细胞发挥直接细胞毒性和促炎作用，导致DAMPs和细胞因子释放，增强促肿瘤微环境。NET相关染色质还可以重塑细胞外基质(ECM)成分并增加血管通透性，从而增强肿瘤细胞迁移和转移生态位定植(图2)。这些效应在多种恶性肿瘤中观察到，包括乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和肺癌，突出了NET介导炎症在肿瘤生物学中的普遍相关性。NETs已被证明可捕获循环肿瘤细胞(CTCs)并促进其粘附到远处器官，从而促进体内转移种植(图2)。此外，肿瘤来源的炎症信号，如CXCL8和G-CSF，刺激NET形成，产生增强肿瘤细胞侵袭和免疫逃逸的反馈回路。此外，通过组蛋白结合剂抑制NETs可在体外抑制癌细胞迁移、侵袭和血管生成。
NETs的促肿瘤影响与肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的活性密切相关，这提供了组蛋白修饰和DNA甲基化之间的机制桥梁。PAD4在NET形成过程中催化精氨酸残基转化为瓜氨酸(瓜氨酸化)，这是一种主要发生在组蛋白H3上的关键PTM。瓜氨酸化中和了组蛋白尾部的正电荷，削弱其与DNA的亲和力，并驱动NET释放所需的染色质去浓缩(图2)。除结构作用外，PAD4直接与DNA甲基化机制相交。具体来说，PAD4可以瓜氨酸化从头DNA甲基转移酶DNMT3A，稳定酶并增强其甲基转移酶活性，导致特定基因组位点的胞嘧啶甲基化增加。此外，PAD4对组蛋白的瓜氨酸化拮抗精氨酸甲基化，促进染色质可及性和基因表达的变化。这种生化串扰被近期证据进一步阐述，表明NET相关组蛋白修饰，包括血清素化-瓜氨酸化串扰，增强转移定植，特别是在肝转移模型中。
NETs与表观遗传学之间的关系被认为是双向的，因为DNA甲基化本身是NET形成的活跃调节因子。DNMTs的药理学抑制，如使用5-氮杂胞苷，诱导整体DNA低甲基化，并已被证明通过上调PAD4表达和增加组蛋白瓜氨酸化来增强NETosis，从而以基本不依赖ROS的方式促进染色质去浓缩和NET释放(图2)。这些发现将DNMTs定位为NETosis的上游表观遗传调节因子，并表明表观遗传治疗可能无意中影响中性粒细胞驱动的炎症。一旦释放，这些NET来源的组蛋白和蛋白酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶，对周围基质发挥直接细胞毒性作用并重塑细胞外基质，增加血管通透性并促进迁移(图2)。
这种重塑不仅限于生态位的结构架构，还积极决定免疫排斥。NETs被证明作为一层致密的物理“面纱”覆盖肿瘤细胞，有效阻碍细胞毒性T细胞与其靶标之间的免疫突触。通过保护肿瘤免受接触依赖性杀伤，这些染色质支架提供了一层免疫治疗耐药的机械屏障，补充了其生化免疫抑制(图2)。重要的是，DNase I处理在检查点抑制后恢复了细胞毒性效应T细胞反应，而PAD4的药理学抑制在体内抑制了癌症转移，这些发现得到早期研究的支持。同样，中和组蛋白导致NET介导的屏障解体，抑制癌症转移，并提高癌症免疫治疗的效果，进一步强化了NETs在肿瘤进展和生存中的作用。
6. cfDNA甲基化和细胞外组蛋白作为癌症的关联生物标志物
如前所述，DNA甲基化是帮助定义细胞身份和基因调控的关键表观遗传标记。它具有高度细胞类型和组织特异性，在发育过程中建立，并在正常条件下在个体间基本保守。反过来，DNA甲基化改变是癌症的标志，在疾病发展早期出现。虽然全基因组DNA低甲基化是恶性细胞的典型特征，表明其作为泛癌生物标志物的潜力，但正是位点特异性CpG岛高甲基化提供了组织来源(tissue-of-origin, TOO)识别所需的粒度。由于cfDNA甲基化模式对其来源细胞保持高保真度，它们允许以高解剖特异性进行非侵入性癌症检测。在健康个体中，血浆cfDNA主要来自造血细胞(白细胞约55-76%，红细胞祖细胞约30%)，血管内皮(约8-10%)和肝细胞(约1%)贡献较小。白细胞增多(白细胞>11,000/μL)常伴随实体瘤，作为炎症、肿瘤进展或副肿瘤反应的标志；有趣的是，白细胞似乎是多种癌症类型中cfDNA的主要贡献者。总的来说，在癌症中，来自特定组织的cfDNA升高与病理相关。例如，在结直肠癌(CRC)中，全基因组发现和验证研究最近确定了血浆cfDNA中可检测到的CpG甲基化标志物面板，以稳健的性能指标(例如组织中AUROC>0.90)区分癌症病例与癌前病变。值得注意的是，cg27541454等标志物在血浆中表现出合理的区分能力，有助于更早干预。类似地，已定义了HCC特异的cfDNA甲基化特征，支持其在早期非侵入性癌症检测以及潜在监测治疗后复发中的价值。肺癌中的系统荟萃分析显示，甲基化靶标(如RASSF1A、SHOX2)以高特异性(86%)检测肺癌，但敏感性适中(54%)，尤其是在早期癌症患者中，表明其作为多模态模型中补充工具以提高诊断准确性的潜力。
这些发现强调了为什么cfDNA甲基化是现代肿瘤学的基石生物标志物。DNA甲基化改变是癌症发展中最早期和最一致的表观遗传事件之一，提供了肿瘤身份的稳定分子档案，即使肿瘤来源的DNA仅占cfDNA总量的一小部分，也能在循环中持续存在。液体活检的非侵入性使得能够在无症状人群中进行重复采样筛查、对不确定发现的患者进行诊断、预后分层以及实时监测治疗反应或微小残留病(MRD)，通常优于或补充基于突变的ctDNA检测和传统蛋白质生物标志物，因为甲基化改变更普遍、发生更早并保持高组织特异性。这推动了临床转化，例如FDA批准的Epi proColon检测检测甲基化SEPT9用于结直肠癌筛查，以及多癌早期检测(MCED)测试如Galleri?测试，通过机器学习分析数千个CpG位点的靶向cfDNA甲基化特征，检测50多种癌症类型的信号并准确预测组织来源。最近，无细胞DNA血液测试SHIELD成为FDA批准(2024年)的第一个作为一线、首选结直肠癌筛查选项的血液检测，在超过20,000名平均风险成人的前瞻性ECLIPSE试验中以90%的特异性检测到83%的结直肠癌。
与其他生物标志物类别如蛋白质(CA 19-9、PSA或HE4)、代谢物或小非编码RNA相比，cfDNA甲基化、细胞外组蛋白/核小体(及其PTMs/变体)以及相关的片段组学特征提供了多种生物学基础且临床验证的优势。例如，小非编码RNA虽然在循环中可检测(常在外泌体内保护)，但可能来自多种非肿瘤细胞类型，表现出更大的分析前变异性，并缺乏与染色质结构和核小体定位的直接机制联系，而片段组学和组蛋白PTMs则提供了这种联系。DNA甲基化模式在癌变早期建立，在体液中高度稳定，并表现出精细的组织和细胞类型特异性，即使在低肿瘤分数下也能实现准确的TOO反卷积。在迄今为止进行的最大规模cfDNA特征头对头比较(CCGA子研究1)中，全基因组甲基化分类器在>99%特异性下实现了最高的癌症信号检测敏感性之一，并在与突变、体细胞拷贝数改变和其他基因组读出相比时，对预测癌症信号来源表现最佳。这些特性支撑了临床验证的MCED检测，如上述基于靶向甲基化的Galleri?测试，补充了特异性较低或解剖覆盖范围有限的特异性器官蛋白质或影像筛查。除病例对照验证外，基于甲基化的Galleri测试在第一个前瞻性干预性多癌早期检测队列(PATHFINDER)中进行了评估，将该测试添加到标准筛查中产生43.1%的阳性预测值和88%的癌症信号来源准确性。与此同时，该分析物类别的组蛋白方面以循环核小体免疫测定(如Nu.Q H3.1和组蛋白-PTM平台)为代表，为基于测序的甲基化检测提供低成本、可扩展的ELISA对应方法。
cfDNA甲基化检测的详细方法学工作流程已优化，以从低输入量、高度片段化的DNA(~150-200 bp)中最大化敏感性。分析前步骤至关重要：优先选择血浆而非血清，并收集在专用稳定管中，立即进行双重离心或过滤以最小化白细胞来源的基因组DNA污染。cfDNA提取利用为短片段设计的优化硅胶或磁珠试剂盒，通常回收5-50 ng/mL血浆。质量评估通常包括荧光定量和片段大小分析，以确认核小体保护的约167 bp峰，向更短片段的转变通常表明ctDNA。甲基化分析本身采用一系列互补技术，根据所需通量、输入量和分辨率选择：(i)位点特异性靶向方法，如甲基化特异性PCR(MSP)、定量MSP或数字液滴PCR(ddPCR)，在亚硫酸氢盐转化后检测已验证的单基因生物标志物(SEPT9、SHOX2)；(ii)基于测序的方法，包括靶向杂交捕获面板或低通全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)，可与片段组学特征整合；(iii)富集方法如cfMeDIP-seq，使用抗5mC抗体在测序前下拉甲基化片段，实现从最小输入量进行稳健的甲基化组分析，并支持组织来源反卷积；(iv)无亚硫酸氢盐酶促转化技术(EM-seq、TAPS)或新兴的单分子长读长平台，直接检测天然cfDNA中的修饰碱基，保留片段完整性并允许甲基化、突变和染色质可及性的同步多组学读出。下游生物信息学流程应用在大型癌症和健康参考甲基化组上训练的机器学习分类器，并仔细校正克隆造血产生的混杂信号。当这些甲基化数据与片段组学或组蛋白PTM谱分析结合时，诊断性能指标(敏感性、特异性、AUC)始终提高，特别是对于多种肿瘤类型的早期检测和癌症亚型分型。
细胞外组蛋白和核小体相关标记通过报告细胞死亡机制(凋亡、坏死、NETosis)、染色质重塑状态和肿瘤-微环境相互作用提供正交生物学信息，这些信息不能直接由稳态蛋白质水平或代谢物谱捕获(后者受饮食、微生物组活动、炎症和肝/肾功能严重混淆)。与许多在良性炎症或代谢条件下非特异性升高的蛋白质生物标志物不同，组蛋白水平和特定PTMs/变体(如H3K4me3、macroH2A1亚型)显示出疾病和组织相关模式，与甲基化或蛋白质标志物结合时可提高诊断准确性，如多变量模型在胰腺癌中实现AUC 0.92-0.95，而CA 19-9单独仅为AUC 0.87，并且在结直肠癌和卵巢癌中，当片段组学与传统蛋白质整合时，早期阶段性能更优。
片段组学本身将功能染色质状态(核小体占据、可及性和调节元件活性)编码为片段大小分布和末端基序，增加了甲基化或蛋白质标志物单独无法提供的动态层面，并进一步提高多模态检测的性能。片段组学的概念将在下一节进一步描述。总之，这些细胞外染色质成分因此构成一个生物学上相互联系、高维且稳定的分析物类别，支持更早检测、更准确的TOO识别、治疗反应和微小残留病的实时监测，以及与现有蛋白质或影像模态的合理组合——这些优势使它们成为传统单分析物生物标志物策略在精准肿瘤学中的强大补充或，在MCED环境中，更优替代方案。
组蛋白和组蛋白复合物在循环中相对稳定，可在血清、血浆和脑脊液(CSF)中检测到。先前研究显示，多种癌症类型中循环核小体水平升高，包括淋巴瘤、肺癌、结直肠癌等，表明其作为泛癌生物标志物的价值。有趣的是，与对照组相比，胶质母细胞瘤患者的血浆样本未显示含H2A、macroH2A1.1或macroH2A1.2的核小体丰度改变。相反，研究表明，与对照组相比，成人胶质母细胞瘤患者中主要检测到单个组蛋白，特别是H2A、H3、macroH2A1.1、macroH2A1.2水平升高，H4水平降低。相比之下，儿童弥漫性中线胶质瘤(DMG)患者中检测到单个组蛋白丰度降低，组蛋白二聚体和四聚体水平升高。此外，H2A和H4水平升高提示肝病进展。单分子血浆分离核小体表观遗传谱分析(Epigenetic Profiling of Plasma-Isolated Nucleosomes, EPINUC)的应用允许对单个核小体上的组蛋白修饰进行多重分析。在DMG患者血浆样本中，反映H3K27M相关染色质改变的这种表观遗传模式有效地区分了患者与健康对照和其他胃肠道恶性肿瘤患者。
cfDNA甲基化和循环组蛋白也已显示出检测非恶性或癌前代谢性肝病的能力，其发生可能是疾病进展和最终发展为HCC的重要风险因素。我们先前证明了儿科NAFLD患者中cfDNA甲基化与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之间的强关联，同时与对照组相比，儿科NAFLD中组蛋白变体macroH2A1.2的循环水平升高。协同作用的潜力进一步得到cfChIP-seq方法开发的支持，该方法捕获修饰的无细胞核小体以揭示来源细胞的实时转录程序。活性组蛋白标记(如H3K4me3)与组织特异性表达模式密切相关，但提供了额外的动态信息层。具体来说，在肝病和结直肠癌患者中，携带活性组蛋白修饰的循环核小体识别了病理相关的基因表达变化，包括肝细胞转录程序改变和HER2扩增。这些发现表明，基于组蛋白的生物标志物可以通过捕获染色质活性和转录调控的持续变化来补充基于DNA甲基化的方法。关于cfDNA甲基化和组蛋白变体/组蛋白标记联合用作癌症微创生物标志物的研究很少。然而，研究结果支持其协同诊断价值(表1)。基于血清的核小体相关DNA甲基化、组蛋白PTMs和组蛋白变体检测显示，对于II期胰腺癌与健康和良性对照，个体ROC曲线范围从0.52到0.77，对于癌症与健康对照，从0.53到0.81。然而，包含五个表观遗传标记(5mC、H2AZ、mH2A1.1、H3K4me和H2AK119Ub)的多变量模型显著提高了诊断准确性，在区分癌症与健康组时AUC达到0.95，而CA 19-9为0.87，在区分癌症与健康和良性组时AUC达到0.92，而CA 19-9为0.84。
