Wnt信号通路的异常激活可导致胞质β-catenin的失控性蓄积，随后该蛋白进入细胞核并促进与细胞增殖和恶性转化相关基因的转录。在本研究中，研究人员旨在利用设计型泛素小体（uAbs）清除胞质中的致病性β-catenin。uAbs是一种嵌合蛋白，由E3泛素连接酶和靶标结合结构域组成，可将细胞内蛋白重定向至蛋白酶体进行降解。为加速uAb开发，研究人员采用一种名为SaLT&PepPr的蛋白语言模型驱动算法，以计算方式设计对β-catenin具有亲和力的“引导”肽，随后将其与人类E3连接酶——Hsp70相互作用蛋白羧基端（CHIP）的催化结构域融合。在结直肠癌细胞中表达所得肽引导型uAbs后，研究人员鉴定出多种设计能够大幅降低胞质和细胞核中异常稳定的游离β-catenin水平，同时保留正常膜相关亚群。这种对致病性β-catenin的选择性敲低抑制了Wnt/β-catenin信号传导，并损害了肿瘤细胞的存活与增殖。此外，在BALB/c小鼠中，经脂质纳米颗粒（LNP）包裹的mRNA递送其中一种最优降解剂后，可选择性地降低肝脏中胞质而非膜相关的β-catenin水平。综上，这些发现揭示了uAbs在体外和体内选择性清除异常蛋白的独特能力，并为其他致病蛋白的肽可编程生物调节剂开辟了道路。
**论文解读：可编程泛素小体实现对致病性β-catenin亚群的选择性降解**
**一、研究背景与现存问题**
Wnt信号通路在细胞增殖、分化、迁移及胚胎发育和组织稳态维持中发挥关键调控作用。β-catenin作为该通路的核心下游效应分子，具有双重功能：一方面通过结合E-cadherin介导细胞间黏附，另一方面通过与T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）转录因子相互作用调控Wnt响应基因的表达。在正常生理条件下，由腺瘤性息肉病杆菌蛋白（APC）和糖原合成酶激酶3等组成的降解复合物可磷酸化β-catenin并靶向使其经泛素-蛋白酶体途径降解。然而，当Wnt信号异常激活时——例如APC基因的功能缺失突变或CTNNB1（编码β-catenin的基因）的功能获得性点突变或缺失——这种降解机制被阻断，异常稳定的β-catenin在胞质中蓄积并转位至细胞核，与TCF/LEF结合驱动c-Myc和Cyclin D1等癌基因表达，促进结直肠癌（CRC）和肝细胞癌（HCC）等多种恶性肿瘤的发生发展。
尽管针对致病性β-catenin的治疗策略具有明确的抗癌潜力，但目前尚无直接靶向β-catenin的获批疗法。传统小分子或单克隆抗体策略因β-catenin的胞内定位、缺乏明确的活性位点以及 intrinsically disordered 蛋白区域而受限。RNA干扰（RNAi）方法如小干扰RNA（siRNA）虽可靶向任何蛋白编码mRNA，但无法区分胞质/核中异常游离的β-catenin与细胞膜上正常的β-catenin——它们由同一基因表达。这种缺乏选择性可能导致膜β-catenin丧失进而削弱细胞间黏附，反而促进肿瘤侵袭和转移。此外，siRNA还存在对长半衰期蛋白敲低效率低及脱靶效应等局限性。因此，亟需能够精准区分病理性与非病理性β-catenin蛋白亚群的替代策略。
蛋白质组编辑技术为靶向蛋白调控提供了新途径，可在翻译后水平实现目标蛋白（POI）的降解、稳定、激活或重定位。在多种蛋白质组编辑工具中，泛素小体（uAbs）——即E3泛素连接酶与靶向肽或蛋白（弹头）基因融合形成的嵌合蛋白——具有高度可工程化优势。然而，许多POI缺乏现成的结合结构域，尤其构象无序蛋白使uAb方法面临瓶颈。研究人员此前开发了多种结构无关的蛋白语言模型（pLM）用于计算设计引导肽，其中SaLT&PepPr算法通过微调ESM-2嵌入来预测目标蛋白的相互作用基序，使连续肽候选物的分离成为可能。
**二、研究目的与技术方法**
本研究旨在利用SaLT&PepPr算法计算设计uAb弹头，实现对胞质和细胞核中致癌性β-catenin的选择性降解，同时保留膜相关β-catenin以维持组织完整性。研究人员构建了包含SaLT&PepPr设计的引导肽与人CHIP催化结构域（CHIPΔTPR）融合的候选uAb面板，在CRC细胞系DLD1中筛选并表征其降解活性。
主要关键技术方法包括：（1）基于SaLT&PepPr算法的计算肽设计，以E-cadherin胞质域（Ecad-CD）和β-TrCP序列为输入预测β-catenin结合肽；（2）蛋白质印迹（immunoblotting）分析评估各uAb对胞质β-catenin水平的敲低效果，并通过亚细胞分级分离区分不同亚群的降解选择性；（3）TOPFlash双荧光素酶报告基因检测β-catenin转录活性；（4）HiBiT标签敲入细胞系进行定量分析；（5）重组蛋白表达纯化后，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和生物层干涉法（BLI）验证结合亲和力；（6）体外泛素化（IVU）实验结合质谱鉴定泛素化位点；（7）蛋白质组学分析评估脱靶效应；（8）脂质纳米颗粒（LNP）包裹mRNA用于体外和体内递送。动物实验中，BALB/c小鼠经尾静脉注射LNP-mRNA（1.0 mg/kg），通过亚细胞分级分离和免疫印迹分析肝脏组织中的β-catenin水平。
**三、研究结果**
**使用SaLT&PepPr设计β-catenin肽引导降解剂。** 研究人员采用弹头-接头-E3泛素连接酶架构，将计算预测的引导肽经柔性GlySer接头连接至人CHIPΔTPR。基于β-catenin与E-cadherin已知相互作用但亲和力较弱（>36 nM）的设计策略，使用SaLT&PepPr算法共生成33个候选肽（10-24个残基），另基于β-catenin与β-TrCP的相互作用鉴定11个额外候选肽。
**鉴定敲低β-catenin水平和活性的uAbs。** 在DLD1细胞中瞬时转染44种uAb编码质粒后，免疫印迹显示除两种外其余uAb均能降低胞质β-catenin稳态水平，其中15种促进≥50%的降低。TOPFlash检测显示多种uAb可将β-catenin信号活性降低75-80%。其中Ecad-9-CHIPΔTPR和Ecad-30-CHIPΔTPR在两种筛选中表现最优；Ecad-19和Ecad-26因共享12残基核心基序被同步选入。MG132实验证实UPP依赖性降解机制。全蛋白质组学分析显示脱靶效应极小。
**引导肽在体外指导β-catenin结合和泛素化。** 纯化的四种uAb对固定化β-catenin表现出强结合而非牛血清白蛋白，Kd值在250-430 nM范围内。IVU实验证实Ecad-30-CHIPΔTPR可催化β-catenin多聚泛素化，质谱鉴定出多个泛素化赖氨酸残基，均位于β-catenin N端第三个区域（氨基酸1-233）。
**引导肽结合β-catenin的armadillo重复结构域。** 结构分析表明SaLT&PepPr预测的肽序列几乎全部位于Ecad-CD的区域III（残基667-684）。AlphaFold3建模显示Ecad-30沿β-catenin凹槽以延伸构象结合arm重复R9-R4。PeptiDerive分析揭示β-catenin氨基酸379-394在相互作用中贡献最大能量。结构域映射实验证实Ecad-30特异性识别arm重复核心结构域。
**肽引导uAbs促进β-catenin突变形式的降解。** 在携带CTNNB1突变的HepG2（CTNNB1WT/Δex3–4）和HCT116（CTNNB1WT/Δ45）细胞中，Ecad-30-CHIPΔTPR均实现强效敲低。在仅含突变等位基因的HCT116衍生克隆W1（CTNNB1?/Δ45）中也观察到类似敲低水平。
**肽引导uAbs选择性去除胞质β-catenin。** 亚细胞分级分离免疫印迹和HiBiT定量分析均显示，肽引导uAbs显著降低胞质β-catenin水平（约50-60%），而膜和核部分β-catenin水平不变。相比之下，CTNNB1 siRNA同样强效降低胞质和核β-catenin但显著降低膜相关β-catenin，缺乏亚细胞定位依赖性选择性。
**uAb驱动的β-catenin消除下调已知靶基因表达。** qPCR分析显示，Ecad-30-CHIPΔTPR显著降低Axin2、Cyp1a2和c-Myc三个已知β-catenin靶基因的转录水平，效果与siRNA相当，而阴性对照组无影响。
**肽引导降解剂影响肿瘤细胞存活和增殖。** MTS活性检测显示四种uAb在转染后24和48小时显著降低DLD1细胞存活率35-50%。克隆形成实验显示uAb显著减少结晶紫染色克隆数，效果与siRNA治疗相当。
**LNP介导的uAb mRNA递送在培养癌细胞中清除胞质β-catenin。** 使用含离子化脂质Lipid 10的LNP递送Ecad-30-CHIPΔTPR mRNA至Hep3B细胞后，观察到胞质β-catenin的强效敲低，且呈剂量依赖性抑制β-catenin信号活性（半最大抑制浓度2.9 nM）。
**LNP递送的uAb mRNA在小鼠中清除胞质β-catenin。** 在BALB/c小鼠经尾静脉注射1.0 mg/kg LNP-mRNA后24小时，Ecad-30-CHIPΔTPR组肝脏胞质β-catenin显著降低而膜部分无明显变化。时间过程研究表明这种选择性降低持续至第5天，第7天恢复稳态水平。
**四、讨论与结论**
本研究描述了一种CRISPR类似的方法，即利用结构无关pLM算法SaLT&PepPr快速设计短引导肽并重定向人E3连接酶CHIP至致病性β-catenin以促进蛋白酶体降解。与RNAi和CRISPR-Cas方法不同，uAb介导的蛋白质组编辑在翻译后水平运作，可在更高分辨率下解析复杂蛋白功能，并能特异性清除特定蛋白状态和定位。研究发现中等亲和力（250-430 nM）的引导肽足以实现高效靶向降解，且不与膜上E-cadherin竞争β-catenin结合，提示高亲和力弹头并非构建有效uAb的最佳选择。
肽引导uAbs在体外和体内均保持了选择性降解特性，体内效应持续约5天。研究观察到β-catenin降解存在约70-75%的上限，这与PROTAC等其他靶向蛋白降解策略一致，提示部分降解可能足以达到预期表型效应。LNP递送方法为uAb的临床转化提供了非病毒、安全且可行的路径。
综上，本研究建立了肽引导uAbs作为一种稳健的蛋白质组编辑技术，能够在体外和体内精确区分致病性和非致病性蛋白亚群，为选择性靶向肿瘤发生的主要致癌驱动因子提供了新的可能性，并为uAb技术平台从概念到临床应用的转化奠定了重要基础。
