异源自噬（xenophagy）是选择性自噬（selective autophagy）中至关重要的过程，对于清除胞内病原体具有关键作用，然而其调控机制仍不明确。在本研究中，乙酰化组学分析（acetylome profiling）鉴定出异源自噬受体NDP52在K202位点发生动态乙酰化修饰，且该位点的去乙酰化在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染过程中显著增强。乙酰转移酶CREBBP/KAT3A与去乙酰化酶HDAC3分别对NDP52 K202乙酰化进行双向调控。去乙酰化形式的NDP52与ATG8家族蛋白（MAP1LC3A/B和GABARAPL2）结合能力增强，从而促进自噬体-溶酶体融合及病原体降解。天然免疫激酶TBK1在S424位点磷酸化HDAC3，通过抑制泛素化依赖性降解来稳定该蛋白，该调控级联反应将天然免疫与异源自噬联系起来。在小鼠体内，肝脏特异性过表达去乙酰化模拟突变体NDP52K202R可降低肝脏中鼠伤寒沙门氏菌载量、减轻肝脏坏死并抑制促炎细胞因子产生。本研究揭示了异源自噬中一种翻译后修饰（post-translational modification, PTM）调控范式，即NDP52乙酰化动态变化可精细调控受体在抗菌应答中的功能，提示HDAC3-NDP52轴可作为感染性疾病的潜在治疗靶点。
**论文解读：TBK1-HDAC3-NDP52信号轴调控异源自噬清除胞内细菌的分子机制**
**一、研究背景与问题**
自噬（macroautophagy/autophagy）作为一种进化上保守的细胞途径，通过溶酶体降解机制清除胞内病原体。宿主细胞还发展出靶向特定胞内病原体（包括病毒、细菌和真菌）的选择性自噬过程，即异源自噬（xenophagy），其构成宿主抵抗细菌感染免疫应答的关键组成部分。异源自噬的选择性由涉及细菌蛋白泛素化和特异性货物受体（如SQSTM1、CALCOCO2/NDP52和OPTN）功能的分子机制介导。然而，某些病原体进化出复杂策略来对抗这些防御机制，通过特定效应蛋白逃避自噬降解甚至利用自噬过程增强其在宿主环境中的存活。尽管已有显著进展，调控病原体识别和细菌清除的分子机制与调控通路仍未完全阐明。NDP52作为选择性自噬中的多功能货物适配蛋白，在靶向鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的异源自噬中具有双重调控功能：其非常规LC3相互作用区（LIR）基序介导与LC3C的特异性结合，促进含沙门氏菌囊泡募集至自噬体；其两个C端锌指结构域介导与肌球蛋白6（Myosin6）的相互作用，调控自噬体与溶酶体融合。已有研究表明NDP52 LIR中T137位点的磷酸化增强其与ATG8家族蛋白的结合，但其他翻译后修饰（PTM）对NDP52功能的调控仍知之甚少。因此，探究NDP52乙酰化修饰在异源自噬中的功能与上游调控机制，对理解抗菌天然免疫具有重要科学意义。
**二、研究内容与结论**
研究人员发现NDP52 K202乙酰化在细胞模型中显著降低，并受KAT3A/HDAC3动态调控。机制上，NDP52 K202去乙酰化增强其与ATG8家族蛋白（包括MAP1LC3A/B和GABARAPL2）的结合，从而促进自噬体-溶酶体融合及随后的病原体降解。此外，TBK1通过磷酸化稳定HDAC3，由此将先天免疫与自噬联系起来，提示HDAC3-NDP52轴可作为感染性疾病的潜在治疗靶点。该论文发表在《Cell Reports》。
**三、主要技术方法**
该研究采用了多种关键技术：靶向代谢组学（液相色谱/质谱联用）分析感染过程中乙酰辅酶A水平变化；定量乙酰化蛋白质组学（乙酰化肽段富集结合timsTOF Pro质谱）鉴定NDP52 K202乙酰化位点；体外乙酰化/激酶实验验证KAT3A和TBK1的直接催化作用；显微镜微球蛋白互作实验评估NDP52与ATG8家族蛋白结合能力；CRISPR-Cas9基因敲除技术构建NDP52、TBK1、HDAC3、KAT3A敲除细胞系；免疫荧光/透射电镜观察自噬体成熟与细菌清除；以及腺相关病毒（AAV9）介导的肝脏特异性基因递送小鼠感染模型（C57BL/6J小鼠，尾静脉注射，剂量为1×1012 PFU/只，腹腔注射RFP标记的鼠伤寒沙门氏菌1×105 CFU/只）。
**四、研究结果**
**（1）鼠伤寒沙门氏菌感染改变宿主乙酰辅酶A代谢和NDP52 K202乙酰化**
靶向代谢组学显示，鼠伤寒沙门氏菌感染期间细胞乙酰辅酶A水平显著升高，病原体清除后明显下降。定量乙酰化蛋白质组学鉴定出511个上调蛋白和264个下调蛋白，以及668个高乙酰化和346个低乙酰化赖氨酸位点。其中异源自噬受体NDP52的K202位点乙酰化在感染清除阶段显著降低，且该位点在不同物种间具有进化保守性。研究人员制备了特异性识别NDP52 K202乙酰化的多克隆抗体，免疫印迹证实感染清除阶段K202乙酰化水平显著低于未感染对照组。
**（2）NDP52 K202去乙酰化促进其与MAP1LC3A/B及GABARAPL2的相互作用**
K202残基位于NDP52的LIR样基序邻近的?1位置。免疫共沉淀实验显示，组成性去乙酰化突变体NDP52K202R在沙门氏菌清除阶段与MAP1LC3A、MAP1LC3B和GABARAPL2的相互作用较野生型NDP52WT显著增强，而与MAP1LC3C的结合不变。基于显微镜的微球蛋白互作实验证实NDP52K202R对三类ATG8蛋白（LC3A、LC3B、GABARAPL2）的结合能力更强。免疫荧光共定位分析也显示NDP52K202R与MAP1LC3A/B和GABARAPL2的共定位比例在感染清除阶段显著增加。
**（3）NDP52 K202去乙酰化促进自噬体成熟**
在NDP52敲除细胞中，LC3阳性泛素化细菌比例显著低于对照细胞，回补NDP52WT可恢复该表型，而回补NDP52K202R显著增强泛素化细菌向自噬体的靶向。LAMP1和LC3B共定位的动力学分析表明NDP52K202R显著提高LAMP1'/LC3B'双阳性细菌的比例。利用mCherry-GFP-LC3串联荧光探针区分自噬体与酸性自噬溶酶体，进一步证实NDP52K202R表达显著促进自噬溶酶体成熟，表明K202去乙酰化通过增强NDP52与MAP1LC3A/B和GABARAPL2的相互作用促进自噬体成熟。
**（4）乙酰转移酶CREBBP/KAT3A介导NDP52 K202乙酰化**
通过筛选一组代表性乙酰转移酶，发现CREBBP/KAT3A是介导NDP52 K202乙酰化的主要乙酰转移酶。体外乙酰化实验证实仅KAT3A能催化NDP52 K202乙酰化，且呈时间依赖性；KAT3A特异性抑制剂A-485显著降低细胞内NDP52 K202乙酰化水平。在KAT3A基因敲除细胞中NDP52 K202乙酰化显著降低，回补KAT3A可恢复。沙门氏菌感染虽不影响KAT3A表达，但明显削弱NDP52与KAT3A的相互作用，伴随K202乙酰化降低。
**（5）去乙酰化酶HDAC3催化NDP52 K202去乙酰化**
HDAC家族抑制剂TSA显著增强NDP52 K202乙酰化，而去乙酰化酶sirtuin抑制剂NAM无此作用。通过HDAC家族代表性酶筛选，NDP52选择性与HDAC2、HDAC3和HDAC7互作，但仅过表达HDAC3显著降低NDP52 K202乙酰化。CRISPR介导的HDAC3敲除增加K202乙酰化，回补HDAC3可逆转；HDAC3特异性抑制剂RGFP966处理后K202乙酰化明显升高。沙门氏菌感染增强NDP52与HDAC3的相互作用，且在细胞外细菌清除后HDAC3蛋白表达显著升高。
**（6）TBK1介导的HDAC3磷酸化调控NDP52 K202乙酰化**
沙门氏菌感染后HDAC3 mRNA水平无明显升高，但蛋白水平增加。蛋白酶体抑制剂MG132显著增加HDAC3表达，提示其积累源于泛素化降解的减少。研究发现细菌感染促进HDAC3在S424位点的磷酸化。组成性去磷酸化突变体HDAC3S424A泛素化显著增加，而组成性磷酸化突变体HDAC3S424D泛素化降低、蛋白稳定性增强。TBK1与HDAC3相互作用并在S424位点磷酸化HDAC3；体外激酶实验证实TBK1直接磷酸化HDAC3 S424。TBK1基因敲除显著降低HDAC3 S424磷酸化水平，TBK1抑制剂GSK8612也明显抑制该磷酸化。细菌感染激活TBK1后可增强HDAC3 S424磷酸化并降低NDP52 K202乙酰化，而TBK1敲除完全消除这些效应，证实TBK1是调控该通路的关键上游激酶。
**（7）NDP52 K202去乙酰化在细胞和小鼠中加速胞内细菌清除**
细胞水平上，NDP52敲除显著削弱细菌清除能力；回补NDP52WT可恢复，而NDP52K202R表达较NDP52WT进一步增强杀菌活性。透射电镜显示NDP52K202R细胞中膜包裹的胞内细菌数量显著减少。在C57BL/6J小鼠模型中，通过AAV9介导的肝脏特异性（TBG启动子）过表达NDP52K202R较NDP52WT更显著地降低感染后第2天肝脏细菌载量、减轻肝脏坏死面积并降低IL-1β等促炎细胞因子表达。
**五、讨论与结论**
本研究揭示了TBK1依赖性HDAC3稳定化和HDAC3介导的NDP52 K202去乙酰化构成的调控轴，协调鼠伤寒沙门氏菌的异源自噬清除。其核心发现包括：NDP52在LIR样基序邻近的保守K202位点被乙酰化，感染后该修饰动态下调；K202去乙酰化特异性地增强NDP52与MAP1LC3A/B和GABARAPL2（而非LC3C）的结合，构成PTM依赖的ATG8家族结合选择性开关；KAT3A和HDAC3分别作为NDP52 K202的乙酰转移酶和去乙酰化酶；TBK1在S424位点磷酸化HDAC3以抑制其泛素化依赖性降解，将天然免疫激活与NDP52去乙酰化直接联系起来。研究存在的局限性在于人鼠NDP52存在显著的种间差异，人源NDP52的关键K202乙酰化位点在小鼠中不保守，小鼠NDP52具有两个独特的乙酰化位点（K194和K292），其上游调控机制和生物学功能尚不明确，限制了对人类NDP52 K202调控机制向小鼠模型的直接外推。研究结论部分翻译如下：本研究证明TBK1在Ser424位点磷酸化HDAC3以稳定该去乙酰化酶；随后HDAC3促进NDP52 K202去乙酰化并加速胞内细菌清除。这些发现拓展了对调控自噬防御的复杂PTM网络的认识，为通过调节TBK1-HDAC3-NDP52通路开发感染性疾病治疗策略奠定了基础。
