综述：组蛋白尾部突变体：解码染色质、发育与疾病多功能工具

组蛋白修饰与转录调控、发育及疾病相关，但其直接功能作用由于同源组蛋白修饰酶的冗余性和混杂性而未完全阐明。基于顺式或反式作用的组蛋白突变体（包括组蛋白H3的赖氨酸到甲硫氨酸（K-to-M）替换及其他癌症相关的组蛋白突变体（oncohistone变体））的实验策略，能够直接探究单个染色质标记，并规避组蛋白修饰酶敲除的潜在混淆效应。在此，作者综述了如何利用组蛋白突变体揭示染色质通路调控生理、病理及实验性细胞命运转变的新原理，并讨论了这些发现未来如何被利用以用于疾病治疗。

组蛋白赖氨酸甲基化研究简史

发现组蛋白修饰酶及其功能复杂性

组蛋白包装DNA形成染色质（chromatin）的概念早已被认识，但组蛋白本身具有调控功能的观点逐渐出现。自1960年代以来，生化研究确定了组蛋白上的共价修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化，其中组蛋白甲基化（histone methylation）发生在赖氨酸或精氨酸残基上。这些早期发现提出了组蛋白翻译后修饰（PTMs）可能直接影响基因表达的可能性，但测试这些修饰的功能意义仍然具有挑战性。随后对位点特异性甲基化的鉴定，最显著的是组蛋白H3赖氨酸（K）4、9、27和36，为理解组蛋白甲基化如何维持活跃或抑制的基因表达状态奠定了概念基础。

“书写”、“擦除”和“阅读”特定类型组蛋白赖氨酸甲基化的酶的发现提供了另一个关键概念进展，并为探究单个染色质标记的功能作用提供了关键手段。例如，组蛋白甲基转移酶中的Su(var)3-9、Enhancer-of-zeste、Trithorax（SET）结构域被证明书写赖氨酸甲基化，而随后去甲基化酶中的Jumonji C结构域被证明擦除这些标记，强调了组蛋白甲基化的动态和可逆性质。类似地，含有Tudor/Proline-tryptophan-tryptophan-proline（PWWP）结构域和Plant homeodomain（PHD）指等的阅读器蛋白随后被证明识别甲基化组蛋白并招募下游效应复合物以调节基因表达。

小鼠的早期敲除研究表明，许多组蛋白甲基转移酶和去甲基酶对哺乳动物发育和组织稳态至关重要，表明组蛋白甲基化是调节细胞身份和细胞命运变化的生理关键机制。然而，随着该领域的成熟，包括广泛获得先进基因组编辑工具如Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9），人们逐渐认识到组蛋白修饰酶敲除导致的表型解释比最初假设的更复杂。这种复杂性源于越来越多的见解，即许多染色质调节因子除了催化功能外还具有非催化功能，这些功能可能差异影响细胞功能。一个恰当的例子是混合谱系白血病-1（MLL1）酶的功能分析，该酶与书写H3K4三甲基化相关。虽然完全破坏MLL1导致小鼠严重的造血缺陷，但破坏MLL1的催化结构域揭示其甲基转移酶活性实际上对造血是可有可无的。事实上，最近的证据表明MLL1通过甲基转移酶非依赖机制保护细胞免受DNA损伤。这些和其他酶的类似发现强调了仅将表型归因于特定组蛋白修饰缺失的困难。

酶冗余是使敲除表型功能解释复杂化的另一个因素。在哺乳动物中，许多组蛋白甲基转移酶和去甲基酶作为具有重叠底物特异性的蛋白质家族存在。酶冗余反映了哺乳动物组织复杂性的增加，并以Polycomb抑制复合物2（PRC2）及其催化亚基Ezh1和Ezh2为例，两者都催化H3K27甲基化。因此，在造血系统中单独删除Ezh2产生相对温和的表型，而同时删除Ezh1和Ezh2导致干细胞和祖细胞的致命耗竭。类似地，单独删除催化与异染色质相关的H3K9三甲基化的Suv39h1或Suv39h2在小鼠中仅导致细微缺陷，而双敲除动物表现出存活能力受损、染色体不稳定和肿瘤易感性增加。这些例子突出了在使用常规敲除方法时，组蛋白修饰酶的冗余性如何掩盖特定甲基化标记的生理重要性。

最后，越来越多的证据表明染色质修饰酶通过甲基化或去甲基化多种组蛋白底物以及非组蛋白底物来“兼职”。这种底物识别的混杂性使得在没有广泛后续实验的情况下，难以将给定敲除表型归因于特定组蛋白修饰或底物。

染色质图谱绘制

下一代测序技术的进步以及成本的降低，通过使得能够在稀有细胞群体中进行全基因组染色质定位，进一步改变了该领域。使用染色质免疫沉淀 followed by测序（ChIP-seq）的早期工作确定了易于扩增的细胞系和组织中经典组蛋白标记的分布。这些研究揭示组蛋白H3赖氨酸4的三甲基化（H3K4me3）通常与活跃启动子相关，H3K27me3与抑制的启动子相关，H3K36me3与活跃基因体相关，H3K9me3与组成型异染色质相关，代表了跨细胞类型的关键经典染色质状态。最近，多功能Cleavage Under Targets and Tagmentation（CUT&Tag）和Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease（CUT&RUN）技术被开发用于使用少量细胞定位染色质状态。

整合跨不同细胞类型的不同染色质标记位置数据，结合碱基分辨率DNA甲基化数据，导致关于个体表观遗传修饰之间协作和拮抗关系的重要见解。例如，在 pluripotent干细胞中整合H3K4me3和H3K27me3数据导致了“二价结构域”（bivalent domains）的鉴定，这些调控区域同时被激活和抑制相关的组蛋白修饰标记，被认为在分化过程中使基因处于待激活状态。尽管二价染色质现在被认为在细胞类型中更普遍，但这些观察为理解通常与干细胞相关的发育可塑性和谱系定型提供了概念框架。使用Assay for Transposase-Accessible Chromatin using测序或Micrococcal Nuclease测序整合染色质可及性数据集，通过揭示开放染色质与标记为活跃组蛋白修饰（例如H3K4me1/2/3和H3K27ac）以及二价结构域的位点正相关，进一步细化了这些染色质状态的功能解释，从而在细胞类型和发展转变中导致更精确定义的调控状态。类似地，比较DNA甲基化和组蛋白修饰谱导致这样的见解：某些组蛋白修饰吸引DNA甲基化（例如H3K9me3和H3K36me3），而其他修饰拮抗DNA甲基化（例如H3K4me3和H3K27me3），尽管在胎盘发育和癌症等特定发育和疾病背景下观察到这些规则的例外。

虽然特定组蛋白残基的甲基化通常与活跃或抑制的转录状态相关，但这些残基的不同甲基化状态为基因调控提供了额外的细微差别。例如，H3K4me1通常与活跃或待激活增强子（enhancers）相关，而H3K4me3与活跃或待激活启动子相关。尽管有大量文献将不同染色质状态与基因表达或抑制相关联，但个体和组合组蛋白修饰的确切功能作用仍未完全理解。这是因为常规酶敲除策略通常导致多个底物的破坏、复合物稳定性改变和补偿途径的激活，使定义单个组蛋白修饰如何促进特定细胞功能变得复杂。这一知识差距促使研究人员开发替代策略来直接检查组蛋白残基。

研究染色质功能的实验性组蛋白突变体

实验性组蛋白诱变涉及用不能再被修饰的残基（例如精氨酸或丙氨酸）替换可修饰的氨基酸，例如组蛋白尾部的赖氨酸。该策略使研究人员能够解耦特定组蛋白修饰对特定细胞功能和表型的贡献与同源酶的贡献。虽然这种方法非常有价值，但它也很麻烦，因为它需要顺式突变所有特定组蛋白类型的拷贝，这些拷贝通常由多基因家族编码。

根据组蛋白替换的类型，效应可以是局部的，通过阻断突变组蛋白上的顺式甲基化，或全局的，通过抑制顺式和反式甲基化（见“Oncohistones: cancer-associated histone mutations redefine chromatin biology”部分）。此外，不同的替换对受影响氨基酸的电荷有不同的影响，这可能影响核小体结构和染色质相关因子的招募。例如，K-to-A突变（例如H3K4A、H3K9A、H3K27A和H3K36A）消除了修饰位点和正电荷，而赖氨酸到精氨酸（K-to-R）突变（例如H3K27R）保留正电荷但阻止组蛋白修饰（乙酰化和甲基化）。

酵母中的开创性研究使用系统性赖氨酸到丙氨酸（K-to-A）组蛋白诱变来绕过酶冗余并直接测试特定组蛋白残基的功能，而随后的果蝇组蛋白替换方法将这种方法扩展到后生动物模型。在果蝇中，跨每条染色体上大约100个经典H3基因拷贝替换赖氨酸27为精氨酸，损害了Polycomb介导的基因抑制和发育模式形成，提供了令人信服的证据，表明破坏的H3K27甲基化本身是先前与酶E(z)缺乏相关的发育表型的基础。最近，Helin实验室以极大的努力将这一分析扩展到哺乳动物细胞，通过用不可甲基化的精氨酸（K-to-R）替换小鼠胚胎干细胞（ESCs）中所有28个组蛋白H3基因（H3.1、H3.2和H3.3变体）的赖氨酸。与果蝇中的发现类似，该研究证实H3K27甲基化的缺失在很大程度上模拟了哺乳动物背景下PRC2缺陷。这些互补的实验方法使得能够直接测试组蛋白修饰在细胞身份、发育、组织维持和疾病中的因果作用。

与局部作用的实验性K-to-A和K-to-R突变不同，实验性赖氨酸到甲硫氨酸（K-to-M）突变，例如H3K9M，显性抑制同源组蛋白甲基转移酶，从而全局耗尽相应的甲基化标记，包括在未突变的组蛋白上。关键的是，K-to-M突变不仅被用作实验工具，而且自然发生在某些类型的癌症中，因此将在下一节讨论。

Oncohistones：癌症相关组蛋白突变体重塑染色质生物学

在人类癌症中检测oncohistones

在癌症患者组蛋白甲基化相关残基处发现的复发性组蛋白突变，为组蛋白密码假说提供了令人信服的支持，该假说认为组合组蛋白修饰指示不同的基因表达状态。在2012-2013年，儿童高级别胶质瘤的基因组分析首次确定了组蛋白H3赖氨酸27的赖氨酸到甲硫氨酸（K-to-M）替换（H3K27M）基因是弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）患者的定义性改变。生化数据显示H3K27M显性抑制PRC2，导致H3K27me2/3水平的深刻全局减少。虽然特定oncohistones抑制甲基化的精确机制仍在研究中，并且可能因不同突变而异，但现有数据表明许多oncohistones比未突变对应物对同源甲基转移酶具有更高亲和力，导致它们的螯合和全基因组甲基化传播的失败。在最初发现H3K27M突变后，测序工作鉴定了多种癌症类型中大量额外的复发性组蛋白突变，包括头颈癌中的H3K4M、软骨母细胞瘤和肉瘤中的H3K36M、儿童胶质瘤中的H3G34R/V，以及淋巴恶性肿瘤中连接组蛋白H1变体的突变。需要提到的是，并非所有oncohistones都以显性方式抑制甲基化，例如H3G34R/V突变局部破坏H3K36和DNA甲基化。此外，oncohistones不仅限于组蛋白尾部的经典K-to-M突变，还包括组蛋白球状结构域和酸性斑内的点突变，这些突变扰乱了染色质信号传导的其他方面，例如染色质可及性。总体而言，对这些甲基化非依赖突变影响的染色质过程和细胞功能的了解仍然相当有限，目前大部分知识来源于下文讨论的K-to-M oncohistones研究。

K-to-M组蛋白突变对甲基化的显性抑制

包含K-to-M替换的oncohistones功能的一个共同原理是它们对组蛋白甲基化的显性负效应。甲硫氨酸在结构上与赖氨酸相似但不能被甲基化。当并入染色质时，K-to-M突变体组蛋白与同源甲基转移酶结合并通过螯合抑制催化活性。在H3K27M的情况下，突变尾部与PRC2的催化组分Enhancer of zeste同源物2（EZH2）结合，抑制其酶功能，从而阻止甲基化的扩散，导致H3K27甲基化的全局减少。类似地，H3K36M抑制SET结构域包含2（SETD2）三甲基转移酶和核受体结合SET结构域（NSD）家族二甲基转移酶，导致H3K36me2和H3K36me3水平的广泛减少，并因此导致拮抗标记H3K27me3的重新分布。重要的是，仅并入少量突变组蛋白（5-10%）——在H3.3K-to-M突变体的情况下——就足以耗尽全基因组的甲基化，包括组蛋白库中未突变的H3.1、H3.2和H3.3拷贝。K-to-M突变的另一个有趣效应是它们减少但不完全擦除特定位点的组蛋白甲基化。例如，H3K27M表达全局减少H3K27me3水平，但保留在静息细胞中具有最高H3K27me3水平的PRC2靶位点亚群的H3K27me3沉积。事实上，一些研究甚至报道在H3K27M表达细胞中特定位点的H3K27me3水平增加，尽管仍不清楚这些变化是oncohistone表达的直接还是间接效应。无论如何，H3K27me3信号在H3K27M突变癌症细胞中的保留和/或增加可能解释了它们为何对EZH2抑制剂治疗保持敏感。

值得注意的是，oncohistones的使用导致了先前对应酶敲除研究未预期的新生物学见解。例如，通过利用H3K4M小鼠模型，研究人员发现H3K4甲基化的缺失导致所有成熟血细胞类型的致命耗竭，即使上游造血干细胞（HSCs）不受影响。然而，令人惊讶的是，在缺乏H3K4甲基化的情况下，定向祖细胞无法分化，揭示H3K4甲基化对原始干细胞池的维持是可有可无的，但对祖细胞成熟以及因此动物的存活是选择性必需的。这种表型与先前的MLL敲除研究形成对比，后者报告了在所有形式H3K4甲基化缺失后HSCs的耗竭。因此，组蛋白突变不仅重新定义了癌症表观遗传学的理解，还为解码染色质调控在胚胎发育、组织稳态、再生和恶性转化等过程中的生理和病理作用提供了新框架。

疾病中Oncohistones和表观遗传重编程

H3K27M突变在大约80%的儿童弥漫性中线胶质瘤和大约60%的成人弥漫性胶质瘤中被检测到，表明它们作为致癌驱动因素发挥作用。除了抑制H3K27甲基化，H3K27M还促进在人和小鼠高级别胶质瘤中重复元件处H3K27ac的异常沉积，导致这些位点的转录增加和组蛋白修饰的广泛重新分布。H3K27M突变的儿童高级别胶质瘤也表现出全局DNA低甲基化。然而，仍不清楚这种低甲基化是H3K27甲基化破坏的直接后果，还是代表恶性转化的间接后果。功能研究表明，单独H3K27M表达仅诱导体外培养后脑神经干细胞自我更新潜能的瞬时增加，而不赋予永生或延迟细胞衰老。然而，当与额外的致癌驱动因素结合时——例如血小板衍生生长因子受体α（PDGFRA）激活和肿瘤蛋白53（TP53）缺失——H3K27M合作驱动小鼠模型中自发性脑干胶质瘤形成。这些结果表明H3K27M表达启动肿瘤发生，但其本身不足以恶性转化细胞。

另一个常见的oncohistone突变涉及组蛋白H3赖氨酸36替换为甲硫氨酸（H3K36M）。这种突变存在于大约95%的良性软骨母细胞瘤中，并且也在未分化软组织肉瘤和头颈鳞状细胞癌中被鉴定。H3K36M细胞中H3K36甲基化的缺失通常伴随拮抗标记H3K27me3的重新分布，特别是在基因间区，导致PRC1定位和基因表达的改变。在功能水平上，H3K36M据报道破坏间充质分化，从而促进未分化肉瘤的形成。有趣的是，在软骨母细胞瘤中，H3K36M突变主要发生在组蛋白变体H3.3而不是经典H3.1。因为H3.3和H3.1被并入不同的基因组区域，Zhang和Fang提出H3.3K36M的染色质沉积模式可能决定其在软骨母细胞瘤中的优先发生和致癌影响。事实上，尽管H3.3K36M和H3.1K36M突变都减少全局H3K36甲基化，但只有H3.3K36M产生癌症相关表型，表明突变组蛋白的基因组定位影响特定背景下的表观基因组重编程和细胞结果。

除了对H3K36甲基化的显性负效应和H3K27me3的重编程，最近显示H3.3K36M表达破坏由Kruppel相关框（KRAB）诱导的H3K9me3向合成报告基因招募启动的表观遗传记忆维持。研究人员提出H3K36me2和H3K36me3能够招募DNA甲基转移酶，其与H3K9me3合作稳定沉默报告基因，并且这种机制被H3K36M破坏。

与K-to-M突变不同，G34突变专门发生在组蛋白变体H3.3中。H3.3G34R/V突变存在于皮质高级别胶质瘤中，而H3.3G34W突变见于骨巨细胞瘤。与K-to-M突变不同，G34替换在突变组蛋白尾部顺式作用，导致局部而非全局甲基化变化。G34突变的结构分析揭示，位置34处的庞大氨基酸替换空间干扰H3K36甲基转移酶SETD2的结合，阻止催化结构域的进入，从而特异性阻断突变组蛋白上的H3K36甲基化。

在骨巨细胞瘤背景下，H3.3G34W通过维持成骨细胞样祖细胞中的转化状态促进肿瘤发生，驱动肿瘤性生长、破骨细胞的病理性招募和骨破坏。然而，在高级别胶质瘤中，H3.3G34R/V突变本身致癌性较弱，甚至可能对肿瘤维持可有可无。相反，致癌改变如PDGFRA突变被共同选择以驱动胶质瘤发生。携带H3.3G34R/V/W突变的小鼠模型证实了突变特异性表型。H3.3G34R动物显示神经异常；H3.3G34W动物表现出间充质缺陷伴随显著肥胖；H3.3G34V小鼠显示介于这两个极端之间的中间表型。在分子水平上，G34R突变减少H3K36me2沉积并损害DNA甲基转移酶DNA methyltransferase 3A（DNMT3A）的招募，导致基因间区CH甲基化的缺失和神经元启动子处CG甲基化的异常获得。这种表观遗传重编程最终导致与神经退行性疾病相关的转录扰动。尽管有这些见解，解释H3.3G34R/V/W/L/M突变的不同生物学后果的统一机制尚未出现。H3.3G34R/V/W/L/M突变的不同发育和病理结果可能反映了替换残基的独特生化特性，差异影响相邻K36残基的PTMs，从而改变染色质书写器、擦除器和阅读器的识别。

总之，oncohistones通过与染色质调节因子的直接或间接相互作用广泛重编程表观基因组景观。这些突变不仅扰乱突变残基本身的甲基化，还扰乱拮抗染色质标记和DNA甲基化的分布，从而重塑全基因组表观遗传状态，促进致癌转化。值得注意的是，oncohistone突变的组织特异性分布表明强烈的背景依赖性，其机制基础仍有待阐明。

组蛋白突变体作为剖析细胞身份染色质调控的多功能工具

组蛋白甲基化在维持细胞身份中的作用

为了探索组蛋白突变体是否可用于识别维持细胞身份的染色质机制，研究人员最近在成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）过程中过表达了携带不同K-to-M突变的复制非依赖性组蛋白变体H3.3；iPSCs的生成通常由于保护体细胞身份和抵抗细胞命运改变的表观遗传机制而效率低下。研究人员发现H3K4M阻断，而H3K9M略微增强重编程，表明H3K4甲基化是重编程所必需的，而H3K9甲基化抑制重编程，与先前抑制多种冗余组蛋白修饰酶的研究一致。引人注目的是，该研究还揭示了H3K36M对iPSC重编程的深刻效应，几乎所有细胞在7天内获得多能性，表明H3K36甲基化是iPSC重编程的主要障碍。重要的是，这种增强是H3K36M表达特异的，未观察到野生型H3.3过表达，表明这不仅仅是H3.3水平增加的结果。机制上，H3K36M驱动转化生长因子β（TGFβ）信号下游体细胞增强子的停用，通过PRC2依赖的H3K27me3沉积导致间充质基因的抑制，并使向上皮细胞状态的转变成为可能。同时，H3K36M促进在H3K36me2耗竭结构域内多能性增强子的激活，伴随H3K27ac沉积和染色质可及性的增加。这些染色质变化促进多能性转录因子的结合，这些转录因子已被证明招募十-十一易位（TET）酶到多能性调控元件并随后实现主动DNA去甲基化。与该模型一致，抑制TET活性损害重编程，即使在H3K36M表达存在下。总之，这些结果与H3K36甲基化在维持细胞身份中的双重功能一致，通过将关键发育途径整合到细胞类型特异性程序的持续表达中，并通过增强子调控拮抗替代谱系程序的表达。

小鼠ESCs中内源性组蛋白基因突变的互补结果已被报道。简而言之，Gehre等人采用顺式作用的K-to-A突变（例如H3.3K4A和H3.3K36A）来研究与启动子和增强子调控相关的组蛋白H3.3变体中K4和K36甲基化的结构和功能需求。研究人员发现纯合H3.3K4A突变显著损害分化，伴随H3.3K4me3的缺失、调控元件处H3.3沉积的大量耗竭、转录程序的改变和染色质重塑复合物招募的减少。相比之下，纯合H3.3K36A突变选择性减少H3.3K36me2沉积，同时很大程度上保留H3.3K36me3和H3.3沉积，对分化仅有轻微影响。H3.3K4A和H3.3K36A对组蛋白甲基化、沉积和分化的差异效应可能反映了H3.3变体在启动子处的富集但相对于经典H3.1/H3.2从基因体的排除。总之，这些发现揭示了H3.3K4甲基化在保护对早期谱系定型关键的启动子完整性中的关键作用。

类似于针对特定H3.3残基的K-to-A方法，Sanker等人使用组蛋白H3K27的靶向突变来剖析Polycomb介导的抑制。该研究证明，用精氨酸完全替换经典H3K27（H3K27R）消除全基因组PRC2介导的H3K27me3沉积，并导致Polycomb靶基因的异常激活，密切模拟PRC2缺陷。尽管H3K27乙酰化——与活跃启动子和增强子相关——在H3K27R突变系统中耗竭，但在退出初始多能性期间，增强子激活、RNA聚合酶II招募和转录共因子MED1的占据在很大程度上被保留。这些发现表明H3K27me3是ESCs中基因调控的关键决定因素，而H3K27乙酰化在这些过程中很大程度上可有可无。

除了影响经典甲基化位点如H3K27和H3K36的突变分析外，影响不可甲基化组蛋白残基的突变体为保护细胞身份的染色质机制提供了有价值的见解。Nacev等人最近显示H3R2C和H3R26C突变体通过受损的PRC2活性降低H3K27me3水平，并破坏间充质祖细胞和ESCs中的分化，说明精氨酸突变如何揭示超越经典赖氨酸残基的Polycomb依赖谱系限制机制。文库规模组蛋白突变体筛选方法扩展了这一框架，使得能够在组蛋白H3和赖氨酸残基之外进行无偏发现。当应用于C3H10T1/2间充质干细胞样细胞时，此类筛选发现了H2B突变体（例如E71K、E76K和E113K）的意外作用，其选择性损害成脂分化，说明可扩展组蛋白诱变如何揭示先前未被注意的指导谱系规范的染色质机制。另一个最近的过表达筛选包含超过4000个组蛋白变体，鉴定了H4G4D作为一个突变体，其在顺式和反式破坏异染色质维持，同时在T细胞中重编程核区室化和转录因子结合景观。未来工作有必要理解这些较少研究的组蛋白突变体的精确分子和生理作用。

总的来说，这些组蛋白突变体研究例证了个体组蛋白残基如何在谱系定型和细胞身份中发挥指导作用，提供了一个直接询问染色质功能的强大平台。

利用组蛋白突变体剖析染色质信号的生理作用

组蛋白突变体揭示染色质通路在组织稳态中的不同功能

在一项开创性研究中，Shilatifard及其同事证明在果蝇胚胎中表达H3K27M或H3K9M突变有效耗尽体内的H3K27和H3K9甲基化，分别导致PRC2靶基因的去抑制和异染色质沉默缺陷。扩展这一范式，Chaouch等人显示H3K27M和H3K36M破坏果蝇中拮抗的H3K27和H3K36甲基化景观的平衡，引起转录失调和发育缺陷，可通过重新平衡拮抗染色质通路来拯救。总之，这些研究确立显性作用组蛋白突变体作为在果蝇中研究染色质通路发育作用的多功能工具，并激励后续努力使用转基因组蛋白突变体工具探测哺乳动物背景下特定组蛋白修饰的生理作用。

Brumbaugh等人生成了第一个实现广泛和可诱导表达H3K9M或H3K36M的转基因小鼠模型。普遍表达H3K36M的小鼠表现出H3K36me2/3的全局缺失、致命贫血伴随红系分化缺陷和HSC池耗竭，以及肠道分泌分化和睾丸中精母细胞分化缺陷。相比之下，普遍表达H3K9M的小鼠存活长达一年，但表现出淋巴定向多能祖细胞的扩增和未成熟B细胞的阻滞，一些动物发展成侵袭性T细胞白血病。这些实验突出表明，将单个氨基酸不同的组蛋白突变体（H3K9M vs H3K36M）引入其他相同的小鼠中，足以全局扰乱两个主要染色质通路，并对哺乳动物细胞和组织维持产生特异的和先前未知的影响。

跟进在H3K36M小鼠中观察到的分泌缺陷，Pashos等人最近将H3K36M表达特异性导向肠道，证明H3K36甲基化调节肠道上皮身份维持和再生过程中的上皮可塑性。在肠道稳态期间，H3K36me3通过限制拮抗H3K27me3的扩散帮助维持细胞类型特异性基因表达。然而，在再生期间，H3K36me3水平降低，导致H3K27me3沉积模式的重新分布。具体而言，H3K27me3水平在某些谱系特异性基因上积累，促进其下调。作为这种染色质重组的一部分，H3K27me3水平在一部分被抑制的发育和再生基因处减少，导致它们的激活、上皮可塑性的增加和修复的增强。在一项互补研究中，Ko等人使用条件小鼠模型研究H3K36甲基化在发育和组织稳态中的作用，该模型在Krt14表达的分层上皮细胞中表达H3K36M。在这种上皮背景中破坏H3K36甲基化导致广泛的组织发育不良，成年小鼠舌头和皮肤中腺体细胞异常增加，与可塑性增加一致。机制上，H3K36M表达导致分化相关基因处H3K36me2的缺失，伴随H3K27me3从被抑制的腺体基因重新分布到这些分化基因，表现为可塑性增加。与其作为oncohistone的作用一致，分层上皮中持续H3K36M表达使动物易于发展成鳞状细胞癌，表明正常稳态和增加的可塑性需要被严格调节以防止恶性转化。

增强子和二价启动子调控的生理询问

为了在体内直接探测H3K4甲基化的作用，Jang等人生成了转基因小鼠，其中使用Myf5-Cre驱动程序将H3K4M表达靶向骨骼肌和前脂肪细胞谱系。正如预测的，H3K4M表达导致H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3水平的全局减少。突变小鼠在出生后不久死于呼吸肌缺陷引起的呼吸衰竭，伴随棕色脂肪组织和背部肌肉质量的中度减少。机制上，研究人员显示H3K4M表达通过破坏增强子相关H3K4甲基转移酶MLL3和MLL4阻止脂肪生成过程中的增强子激活。事实上，在前脂肪细胞中删除MLL3/4的催化SET结构域模拟了H3K4M小鼠中观察到的缺陷。相比之下，H3K4M在分化脂肪细胞中的表达对脂肪组织维持影响很小。这些发现表明H3K4单甲基化是脂肪发育所需但对维持可有可无的。

如前所述，研究人员最近开发了允许在不同组织中可诱导表达H3K4M或H3K27M的小鼠模型。用多西环素处理的成年H3K4M小鼠在几周内变得垂死，由于特异性祖细胞阻滞导致所有成熟血细胞的深刻缺失。引人注目的是，停用多西环素容易恢复H3K4甲基化，允许祖细胞恢复分化，并逆转发病率，证明阻滞的祖细胞在H3K4甲基化正常化后保持完全功能，进一步突出了可诱导组蛋白突变体探测由破坏组蛋白甲基化引起的表型可逆性的多功能性。在分子水平上，启动子处H3K4me3的缺失由于拮抗H3K27me3的沉积导致命运指导基因的异常沉默。转录和染色质谱进一步揭示相关启动子强烈富集二价（H3K4me3⁺/H3K27me3⁺）染色质。重要的是，使用H3K27M转基因抑制H3K27me3水平恢复了基因激活，拯救了造血分化，并显著延长了H3K4M小鼠的存活。值得注意的是，H3K27M未能恢复H3K4M小鼠中的增强子相关染色质标记，表明观察到的表型主要由启动子失调驱动。因此，启动子H3K4三甲基化和H3K27三甲基化之间的平衡，特别是在二价基因处，对保护哺乳动物造血分化至关重要。更广泛地说，这些实验强调了组蛋白突变体工具不仅在特定细胞命运转变期间探测单个组蛋白修饰的作用，而且探测组合作用的能力。

组蛋白突变体工具的概念和技术局限性

虽然组蛋白突变体策略提供了研究染色质生物学的强大工具，但在解释这些系统结果时应考虑几个概念和技术局限性。组蛋白突变体可同时影响多个染色质特征，从而对将观察到的表型归因于单个组蛋白标记缺失构成潜在挑战。例如，赖氨酸残基可根据染色质背景经历多种类型的修饰，包括甲基化、乙酰化或泛素化。因此，替换赖氨酸残基的突变不仅消除靶向甲基化标记，还消除同一位点上的其他潜在修饰。组蛋白突变体对这些额外修饰的影响还取决于替换类型（即它是顺式还是反式作用）和组蛋白变体类型。

此外，组蛋白突变体策略通常破坏多个甲基化状态，例如给定组蛋白位点的单、二和三甲基化，因为组蛋白突变体经常抑制催化不同甲基化状态的多种酶。因为这些甲基化状态与不同的染色质功能相关，可能难以确定哪个特定甲基化状态对给定表型负责。而且，螯合模型意味着K-to-M突变体可能不仅影响催化活性，还影响同源酶的非催化功能。因此，在组蛋白突变体模型中检测到的一些表型可能反映几个调控网络的联合破坏，而不是单个组蛋白标记的特定缺失，需要使用药理学或遗传学抑制单个酶的后续实验。一个恰当的例子是H3K4M诱导的脂肪细胞分化缺陷由H3K4单甲基化驱动，而H3K4M诱导的造血祖细胞成熟缺陷由H3K4三甲基化驱动。

组蛋白突变也可以改变组蛋白尾部本身的化学性质，潜在影响核小体与DNA、组蛋白、组蛋白伴侣或染色质相关蛋白的相互作用，与修饰状态无关。事实上，球状结构域内的突变破坏组蛋白-组蛋白相互作用并损害核小体八聚体稳定性，从而扰乱转录程序和细胞身份。由于这些原因，互补方法对于建立组蛋白修饰与生物表型之间的因果关系仍然至关重要。靶向组蛋白修饰酶的催化敲除或点突变模型为酶的催化作用提供了有价值的辅助证据。尽管酶敲除模型的解释通常因酶冗余和混杂性而复杂化，但酶扰动和组蛋白突变体表型之间的仔细比较有助于解开染色质调节因子的催化与非催化以及位点特异与混杂作用。例如，组蛋白突变体模型和特定甲基转移酶催化失活之间的表型相似性和差异可以加强受影响的组蛋白修饰本身起因果作用的结论。

某些组蛋白突变体的另一个潜在限制是它们可能导致组蛋白甲基化的全局减少但局部增加，后果不明。例如，H3K27M突变据报道导致PRC2靶处H3K27me3峰升高，尽管最近数据表明这些峰可能是基因表达次级变化引起的伪影。无论如何，已确定突变组蛋白主动重编程染色质调控网络。事实上，生化和蛋白质组学研究已鉴定突变体特异性与染色质调节因子的相互作用。例如，Reinberg及其同事使用定量生化和质谱方法显示H3K27M核小体可以捕获PRC2并抑制其甲基转移酶活性。这些发现突出了整合生化和蛋白质组学分析以理解组蛋白突变的机制基础和功后果的重要性。一个关键剩余挑战是区分组蛋白突变体表达后的初级和次级染色质效应。尽管可诱导时间过程研究相对较少，多西环素诱导的H3K27M系统显示H3K27me3缺失在诱导后约12小时内迅速发生，与对PRC2活性的直接效应一致。相比之下，后来的染色质和转录变化可能是次级后果。系统的时序染色质谱分析有必要澄清分子变化的时间层次。

最后，依赖组蛋白突变体过表达的研究可能引入与非生理伪影相比内源性敲入模型，强调包括野生型组蛋白过表达对照的重要性。展望未来，组蛋白突变体模型与互补遗传、生化和基因组方法的整合对于充分解释表型至关重要。这些方法将完善组蛋白突变体范式，并揭示组蛋白标记如何调节发育、组织稳态和疾病。

结论和未来展望

组蛋白突变体策略最近已成为补充靶向组蛋白修饰酶的传统遗传敲除方法的强大工具。通过选择性扰动单个染色质标记，这些工具揭示了特定修饰在转录调控、细胞身份、谱系定型、组织稳态和癌症中的因果作用。与受酶催化和非催化功能以及酶冗余复杂化的常规组蛋白甲基转移酶敲除不同，组蛋白突变体提供了询问染色质功能的显性方法。因此，研究人员得出结论，组蛋白突变体作为酶敲除方法的强大互补策略，用于定义染色质修饰的功能作用，每种策略各有优缺点。

可诱导、可逆和组织特异性突变系统使得能够对表观遗传调控进行时间和背景特异性剖析，使研究人员能够发现组蛋白修饰在发育、再生和疾病进展中的动态作用。整合组蛋白突变体模型与互补基因组、生化和蛋白质组学方法对于剖析组蛋白修饰、染色质调节因子和转录程序之间的机制相互作用至关重要。此外，将组蛋白突变体工具与最近的谱系追踪技术（如CRISPR-based DNA条形码系统，例如CRISPR-activated repair lineage tracing（CARLIN）和Doxycycline-inducible array repair lineage tracing（DARLIN））结合，将使得能够在体内追踪克隆动态、干细胞异质性和疾病的细胞起源。

研究人员预期组蛋白突变体策略将阐明表观遗传记忆和可塑性的原理，并揭示如何调节特定染色质状态以恢复组织功能或逆转恶性肿瘤。从转化角度看，定义与特定组蛋白修饰相关的脆弱性可能为靶向治疗开辟途径。重要的是，组蛋白突变体驱动的染色质状态的表观遗传可塑性表明，瞬时染色质调节可以将衰老或恶性细胞重编程为正常组织功能或增强肿瘤对联合治疗的敏感性。最终，oncohistones和工程组蛋白突变体提供了一个多功能平台，不仅用于解码染色质调控和细胞身份，还用于将机制见解转化为组织 rejuvenation和癌症治疗策略。