Bradford实验的蛋白标准曲线是线性的吗？

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）测蛋白浓度，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白定量方法具有超过其他几种方法的突出优点，操作简便，反应迅速且稳定，灵敏度高，干扰因素少，因而得到广泛的应用。其原理是：考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色，形成的复合物颜色深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比关系，因此可通过测定溶液在595nm处的光吸收度值来计算溶液中蛋白质的含量。

然而，即便是Bradford本人，也观察到反应有一定程度的非线性，在蛋白浓度跨度变大时曲率就会渐渐变得明显，只有在2-10 μg/ml（反应液中的浓度）这一比较小的BSA浓度跨度下才适合绘制蛋白标准曲线。这个非线性是由染料自身的特性造成的，即染料与蛋白结合前后的吸收光谱有重叠。

游离的G250染料有多个光吸收峰。在反应条件下，染料处于酸性环境中，此时染料有红、蓝、绿三种颜色形式，处于平衡状态，这三种颜色形式分别对应的吸收峰为470、590、650 nm。与蛋白结合的染料分子是蓝色形式，吸收峰在590 nm，其与蛋白结合后产生的复合物吸收峰在594 nm。这也就意味着，在以594 nm波长进行检测时，有部分光吸收值是由游离染料产生的，这部分光吸收值是作为检测背景存在的。在反应过程中，随着蛋白与染料的结合，游离染料分子的浓度下降，使得594 nm检测背景值降低，从而引起线性关系的扭曲。下图显示了游离染料和染料-蛋白复合物的光吸收谱。

这种线性关系的扭曲，可以通过不同的计算方法进行修正。由于游离染料的三种颜色形式处于平衡状态，因此，可以通过在450 nm检测红色形式的染料，间接判断594 nm检测背景的下降程度。由于反应过程中蛋白和游离染料的浓度变化都会对反应的线性关系造成影响，根据比尔定律，采用OD594与OD450的比值进行公式计算，可以获得与蛋白浓度的线性关系，同时还可以提高蛋白标准曲线的斜率，以及一定程度上提高检测灵敏度。实验范例见下图，理论推导过程在此省略，感兴趣的朋友可阅读下文所附的参考文献。

（图中BSA蛋白浓度为反应液中的浓度）

使用OD594/OD450拟合时，需要注意，此时的背景值是指水的光吸收值，并非不含蛋白的染色液的光吸收值。如缺乏合适滤光片，也可使用590-600 nm和450-485 nm（染料-蛋白复合物在485 nm以下波长没有光吸收）的任意波长进行读数。

参考文献：Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies，ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 236, 302–308 (1996)