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越来越多的证据表明，微生物组在肿瘤发生中发挥着关键作用，其作用超出了遗传学范畴。ApcMin/+小鼠在无特定病原体条件下饲养时肿瘤负荷降低。然而，遗传因素如何塑造微生物群，以及菌群失调如何适应肠道肿瘤发生的遗传范式仍不清楚。上皮干性受Wnt/Apc/β-连环蛋白通路调控，而Apc突变和Hippo信号与肿瘤生长相关。侵袭性致病菌作为上皮屏障功能障碍的结果从微生物群中出现。研究人员假设侵袭性致病菌的出现和上皮微生物群的菌群失调有助于增加肿瘤干性。研究人员纵向监测了出生于野生型代孕母鼠的ApcMin/+和野生型同窝小鼠的上皮和粪便微生物群。观察到ApcMin/+和野生型小鼠的上皮微生物群在出生后8周即发生分离，而粪便微生物群在20周龄时发生分化。在ApcMin/+小鼠中观察到上皮菌群失调和屏障缺陷，其特征为具有侵袭性特征的胞内大肠杆菌。虽然抗生素治疗减少了肿瘤负担，但侵袭性大肠杆菌感染促进了肿瘤球体的形成。在细菌感染的肿瘤球体中观察到Vgll3和Tead4（Hippo效应因子）以及Cd44（一种肿瘤干性标志物）的表达更高。从机制上讲，细菌通过增强VGLL3/TEAD4介导的CD44启动子活性来增强上皮克隆形成能力。侵袭性大肠杆菌遗传特征在人类结直肠癌标本中得到验证，86%的标本呈阳性，并且观察到与TEAD4表达呈正相关。总之，Apc突变驱动侵袭性致病菌的扩增，通过VGLL3/TEAD4/CD44轴促进肿瘤干性。针对细菌的干预措施可能成为遗传性肿瘤患者的替代策略。

研究背景与意义

肠道癌症主要起源于形成于宿主与微生物群界面的上皮细胞腺癌。除了基因突变外，目前广泛认为微生物群失调在结直肠癌（CRC）的发生发展中起着至关重要的作用。在家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者以及CRC患者的粪便和黏膜活检标本中，均报告了较高丰度的大肠杆菌。由腺瘤性息肉病 coli（APC）基因突变引起的遗传性FAP患者在年轻时就发展出许多良性息肉，恶变风险较高。FAP患者中黏膜相关大肠杆菌的高丰度暗示菌群失调可能是肿瘤发生的原因而非结果，但菌群失调的起源及其在CRC遗传范式中的作用仍不明确。已有研究证实微生物群在CRC发展中的因果作用，例如无菌条件下饲养的Apc基因突变小鼠肿瘤负荷极低。此外，腺瘤相关的屏障缺陷和细菌渗透是Apc等位基因缺失驱动的上皮癌的早期事件。共生源性机会性病原体（称为致病菌）与致癌作用的联系也日益受到关注。然而，驻留微生物从共生菌转化为侵袭性细菌的时间进程数据仍然缺乏。

本研究探讨了上皮和粪便微生物群随时间的变化，表征了Apc^Min/+小鼠体内的胞内细菌，评估了侵袭性大肠杆菌对肿瘤生长和肿瘤克隆形成的影响，并研究了其潜在的信号通路，验证了人类CRC标本中微生物特征与宿主基因表达的相关性。该研究发表于《Gut Microbes》。

关键技术方法

研究采用了多种技术方法。动物模型方面，使用了通过体外受精技术培育的Apc^Min/+小鼠及其野生型同窝小鼠，并在特定时间点进行抗生素处理或致病菌接种。微生物分析方面，收集了不同周龄小鼠的上皮和粪便样本，进行了基于PacBio Sequel II平台的高通量全长16S rDNA测序以分析α多样性和β多样性，并使用实时荧光定量PCR检测了细菌基因水平。细胞实验方面，使用了人结直肠腺癌细胞系Caco-2进行细菌攻毒实验，并结合庆大霉素保护试验计算胞内细菌数量；通过蛋白质免疫印迹分析了蛋白质表达及核质分布情况；利用荧光素酶报告基因检测评估了CD44启动子活性；并通过克隆形成实验和肿瘤球体培养评估了细胞的干性特征。分子生物学操作方面，涉及慢病毒介导的基因敲低以及质粒过表达技术。临床验证方面，收集了来自台湾大学医院（NTUH）的57例人类CRC手术标本，分别提取DNA和RNA以进行细菌基因定量和宿主基因表达分析，并计算了两者的皮尔逊相关系数。

研究结果

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微生物群参与Apc^Min/+小鼠的肿瘤发生机制
研究人员纵向监测了同窝小鼠的肿瘤负荷和微生物群组成。结果显示，在无菌条件下，Apc^Min/+小鼠肿瘤缺失或负荷极低。通过在特定周龄进行为期一周的抗生素治疗，发现8周龄时的抗生素处理显著降低了Apc^Min/+小鼠中后期小肠的肿瘤数量和面积，证实了肠道微生物群参与了肿瘤发生，且治疗时机是决定肿瘤结局的重要因素。
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Apc^Min/+小鼠上皮和粪便微生物群的构成
通过对4、8和20周龄小鼠样本进行16S rDNA测序分析，发现虽然出生时微生物群相似，但在8周龄（断奶分笼后）时，Apc^Min/+和野生型小鼠的上皮微生物群已发生分离，而粪便微生物群直到20周龄才出现分化。这表明上皮菌群失调早于粪便菌群失调，并与肿瘤起始时间相吻合。此外，研究人员观察到Apc^Min/+小鼠微生物群中埃希氏菌属的相对丰度显著增加。
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高丰度的具有侵袭能力的胞内大肠杆菌导致了Apc^Min/+小鼠独特的上皮微生物群
通过qPCR和庆大霉素保护试验，研究人员在20周龄Apc^Min/+小鼠的上皮样本中检测到更高水平的侵袭性大肠杆菌遗传特征（如uidA、capA和dhbF基因）。从Apc^Min/+小鼠中分离出的胞内大肠杆菌菌株在与人Caco-2细胞共培养时，表现出比共生菌DH5α高出1000倍的侵袭能力，且与已知的致瘤性大肠杆菌LI60C3的侵袭能力相当。
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侵袭性大肠杆菌促进Apc^Min/+小鼠的肿瘤生长并上调Hippo效应因子表达
在实验性致病菌模型中，接种LI60C3（而非缺失htrA基因的ΔHtrA菌株）增加了Apc^Min/+小鼠的肠道肿瘤负荷，但在野生型小鼠中未诱发肿瘤。感染后，小鼠肠道类器官体积增大。基因表达分析显示，LI60C3感染并未改变Wnt/β-连环蛋白通路基因，而是特异性上调了Hippo通路相关辅因子Vgll3和转录因子Tead4的mRNA和蛋白水平，同时增加了肿瘤干性标志物Cd44的表达。
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侵袭性大肠杆菌在体外增加肿瘤克隆形成能力
在体外Caco-2细胞共培养实验中，暴露于侵袭性大肠杆菌后，细胞形成了更大更多的肿瘤球体，克隆形成效率显著提高。流式细胞术分析显示，细菌感染将静止期细胞推向活跃增殖，加速了细胞周期进程。感染后，多种干细胞标志物（如NANOG、SOX2、ALDH1A1、BMI1）以及CD44的标准亚型（CD44s）和剪接变体（v3、v6）的表达均有所增加。
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侵袭性大肠杆菌通过上调VGLL3/TEAD4通路促进肿瘤干性
机制研究表明，细菌感染4小时后，Caco-2细胞中VGLL3蛋白发生核转位，而YAP、TAZ或β-连环蛋白未发生此现象。随后，VGLL3总蛋白及CD44v6水平升高。LI60C3（而非ΔHtrA）能够增强CD44启动子活性并促进克隆形成，这一过程可被TEAD4激活抑制剂verteporfin阻断。此外，敲低TEAD4基因可减少细菌感染诱导的球体面积和细胞周期速率，证实了VGLL3/TEAD4/CD44轴的驱动作用。
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人类CRC中侵袭性大肠杆菌与Hippo效应因子的正相关
生物信息学分析显示，TCGA数据库中约3%-7%的CRC患者存在TEAD4基因改变，且原发肿瘤中的TEAD4表达高于正常组织。在临床队列研究中，超过86%的人类CRC标本中检测到了侵袭性大肠杆菌LI60C3的特定遗传特征（capA和dhbF基因）。更重要的是，这些细菌标志物的水平与人类TEAD4基因表达呈显著正相关，而在通用大肠杆菌标志物和TEAD4之间未观察到这种相关性。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究结果表明Apc^Min/+小鼠的肿瘤发展不仅源于宿主基因突变，还源于微生物群失调。早期获得的共生菌在成年后转化为致病菌，Apc突变驱动的侵袭性大肠杆菌扩增增强了肿瘤克隆形成能力。侵袭性大肠杆菌通过VGLL3/TEAD4/CD44轴直接促进肿瘤干性，且该过程独立于免疫细胞激活。上皮菌群失调早于粪便菌群失调，提示局部微环境的早期破坏。此外，研究强调了Hippo信号通路与Wnt通路在调节肠道干细胞自我更新中的协同作用。

结论部分翻译如下：

总之，宿主遗传驱动的侵袭性大肠杆菌扩增通过诱导肿瘤干性加剧了肿瘤发生。侵袭性致病菌通过VGLL3/TEAD4轴增加与CD44上调相关的肿瘤克隆形成能力。致瘤性大肠杆菌的遗传特征可作为CRC进展的生物标志物。了解微生物动态如何与上皮细胞行为相互作用对于揭示癌症预防和治疗中的潜在治疗靶点至关重要。研究人员的数据支持使用细菌精准医学作为管理CRC（包括遗传性亚群）的替代策略。

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